环境胁迫对黄芩次生代谢产物的影响

王伟杰，徐东川，张秀如，于明，林慧彬

（1.山东中医药大学药学院，济南 250355；2.山东省中医药研究院，济南 250014）

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，是中国常用大宗药材，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效［1］。研究表明，黄芩所含的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分具有抗炎、抗氧化、抗癌、保护心血管、保肝、抗菌等作用［2，3］。根据“逆境效应”理论，适当的外部胁迫有利于药用植物次生代谢产物的产生和积累［4］，通过提高黄酮类次生代谢产物的含量来提高药效成为黄芩研究的热点［5，6］。因此本研究分析了黄芩黄酮类化合物合成的途径，总结了栽培过程中干旱、光照、温度、土壤等环境因子对黄芩黄酮类化合物合成与积累的影响，以期为优化黄芩的栽培方法、提高黄芩产量和质量提供科学依据。

1 黄芩黄酮类化合物的合成途径

通过对黄芩黄酮类化合物化学结构和合成机制的研究，有利于分析黄芩在面对胁迫时体内的关键基因、酶的动态变化，从而认识不同类型胁迫对黄芩生长发育的影响。黄芩黄酮类化合物是由环A 和环B 两个苯环通过3C 链连接而成的具有三环化学结构（C6-C3-C6）的多酚类植物次生代谢产物，其生物合成经历了三个阶段。

在第一阶段中，通过苯丙烷途径将苯丙氨酸合成4-香豆酰辅酶A［7］。研究发现，参与这一过程的酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、香豆酸辅酶连接酶（4CL），在PAL 的作用下L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在C4H 催化下羟基化合成香豆酸，在4CL 的作用下，通过ATP 和Mg2+将香豆酸和肉桂酸分别转化成香豆酰辅酶和肉桂酰辅酶［8］。

在第二阶段中，在查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）两种酶的作用下进入黄酮合成途径。首先，CHS 能将一分子的香豆酰辅酶或者肉桂酰辅酶与三分子的丙二酰辅酶转化成柚皮素查尔酮或者松属素查尔酮。之后，CHI 催化上述两种前体物质生成二氢黄酮类化合物柚皮素和松属素。

在第三阶段中，二氢黄酮会通过不同酶生成不同种类的黄酮类化合物。黄芩黄酮类化合物通过黄酮合酶（FNS）合成。黄芩苷元在黄芩素7-O-葡萄糖醛酸转移酶（UBGAT）作用下转化为黄芩苷类物质。黄芩苷类物质通过β-葡萄糖苷酸酶（GUS）水解为黄芩苷元类化合物。黄芩黄酮类化合物合成途径如图1。

图1 黄芩黄酮类化合物合成途径

2 环境胁迫对黄芩次生代谢产物的影响

2.1 干旱胁迫对黄芩次生代谢产物的影响

干旱胁迫是限制药用植物生长最普遍的环境因素［9］。水分的缺失会导致植物叶片含水量降低，气孔关闭，叶片内部CO2的浓度由于扩散阻力的增加而显著降低，使得NADP+的浓度降低，最终使得氧自由基大量增加，从而影响黄芩正常的生长发育和次生代谢产物的积累［10］。程林［11］对一年生和二年生黄芩面对生态胁迫的生理生态变化进行了研究，发现处于营养期和生殖期的黄芩受到干旱的影响更大，因此在这个时期应该保证适当的水分供应。同时，管仁伟等［12］通过代谢组学研究了黄芩在干旱胁迫时体内黄酮类成分的变化规律，发现适度的干旱胁迫有利于黄芩有效成分的积累，但促进程度有限，而随着干旱程度的加大和时间的延长会影响次生代谢产物的合成与积累。当黄芩面对干旱胁迫时，会通过一系列生理生化作用改变影响黄芩次生代谢产物合成的基因、酶等的表达量从而抵御干旱胁迫。Cheng等［13］研究在干旱胁迫过程中黄芩生理特性的变化，发现随着干旱胁迫时间的延长，脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白质（SP）等渗透调节物质含量先升高后下降，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性先升高后降低。这说明黄芩能够通过渗透调节物质的含量来改变水势适应干旱胁迫，通过抗氧化酶含量变化减轻干旱胁迫影响。干旱胁迫还会诱导激素含量的变化以适应胁迫过程中产生的活性氧。转录调控因子能够影响次生代谢产物合成过程中关键酶基因的表达。研究发现，在苯丙烷途径过程中，SbMYB2 和SbMYB7 能够通过上调合成的第一步，下调最后一步来影响黄酮类化合物的生物合成，而在GA3（赤霉素）处理后发现，SbMYB8 与SbCHS、SbC4H 的启动子相结合从而提高黄酮类化合物合成过程中关键基因的表达［14-16］。因此，在干旱胁迫过程中，MYB 转录因子能够通过影响关键酶基因的表达来响应干旱胁迫，进而促进次生代谢产物的积累。

2.2 光照胁迫对黄芩次生代谢产物的影响

光是植物生长发育过程中必不可少的环境因素，是植物进行光合作用制造有机物的重要能源［17］。光照能够通过光照度、光周期以及光质三个方面影响植物的生长发育［18］。Sun等［19］在研究光强对黄芩生长的影响中发现，光强大能够加快黄芩光合色素的合成，提高初级代谢产物的含量，增加了合成次生代谢产物的前体物质，与此同时促进了相关酶的表达从而提高黄芩次生代谢产物的含量。蔡葛平［20］分别用8、12、16 h 的光周期培养黄芩发现，有关黄芩黄酮类化合物合成的关键酶基因在黑暗条件下转录水平升高，因此，短光照周期（8 h 光照，16 h 黑暗）更有利于将糖类转化成黄酮类化合物。研究光质对黄芩的影响发现，白光、蓝光、红光有利于黄芩鲜重的积累，而随着紫外光照射时间的延长，会引起植物子叶卷曲、腋生分枝、叶片加厚等；在植物细胞内部导致叶绿素含量降低从而影响光合作用，并且呼吸作用增强，从而导致黄芩生物量降低；但是紫外光有利于PAL 和黄芩苷的合成［21-24］。

同时，研究发现光照胁迫通过内源激素的变化影响黄芩次生代谢产物的合成。光照能够使刺激CHS 表达的生长激素（IAA）持续减少从而影响黄芩苷的合成；而细胞分裂素（ABA）在促进细胞分裂过程中会消耗大量的碳水化合物，影响了黄酮类化合物前体的合成［25］。

2.3 温度胁迫对黄芩次生代谢产物的影响

温度过高会使植物叶片萎靡、体内钙离子沉淀，从而破坏植物体内叶绿素。同时，温度能够改变植物的生理生化特性，通过影响药用植物体内酶的活性来影响其光合作用、呼吸作用等，进而改变体内次生代谢产物的含量［26］。不同植物生长发育与次生代谢产物积累所需要的最佳温度不同。在对黄芩的研究中发现，在一定范围内提高温度会使黄芩生物量不断加大，但是黄芩苷在25 ℃下积累量最高，较高或较低温度均不利于黄芩苷的合成与积累［27］。Yuan等［28］的研究发现，长期的高温环境尽管对黄芩细胞造成了一定的损伤，但是对细胞生长、干物质的积累并没有产生影响。而黄芩细胞中PAL 活性降低，导致合成的黄芩苷、黄芩素含量降低，于此同时，POD、GUS 活性增强，促进黄芩苷水解为黄芩素参与到清除活性氧的工作中，二者共同导致了在持续高温环境中黄芩黄酮类化合物含量下降。王帅［29］的研究发现，适当的低温胁迫和较大的温差更有利于黄芩体内次生代谢产物的积累。当黄芩受到适当的高温或者低温胁迫时，体内会产生大量的活性氧，抗氧化酶作为体内清除活性氧的第一道防线活性增强，而PAL 的活性会随着温度的提升而增强，这促进了黄芩体内黄芩苷含量的提升。但是随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加深，与黄酮类化合物合成相关的PAL、C4H、4CL、CHS 等酶活性增加，但是黄芩苷的含量却下降，这可能是黄芩苷水解成黄芩素参与清除活性氧造成的。

2.4 土壤因素对黄芩次生代谢产物的影响

2.4.1 重金属胁迫的影响 重金属元素包括必要元素和非必要元素，其含量超过了植物的承受范围就会对植物生长发育产生胁迫作用。土壤中重金属元素能够通过抑制叶绿素的合成以及细胞的生长，对药用植物正常的生长发育产生影响。土壤中必要重金属元素如Cu、Fe、Zn 等对植物生长发育、氧化还原反应以及其他代谢过程中起到重要的作用，同时一些非必要重金属元素如Pb、Hg、As 等对不同药用植物的作用需要具体研究［30］。Li等［31］在铝胁迫对黄芩光合作用影响的研究中发现，当土壤环境的pH 低于5 时会使铝变为Al3+，过量的铝胁迫会使黄芩气孔面积降低，胞间CO2浓度急剧上升，从而影响黄芩的光合作用。土壤中也有其他的无机元素如Se、K、Fe、Mn 对黄芩苷的合成具有促进作用［32，33］。Cao等［34］在砷对黄芩生长影响的研究中发现，在土壤中添加低浓度的As时，有利于促进黄芩根的生长，但是对于黄芩黄酮类化合物没有显著影响；在土壤中加入高浓度As时，会使黄芩生物量降低，黄芩苷、汉黄芩苷含量降低，但提升了黄芩素和汉黄芩素的含量，并且苷类减少的幅度与苷元上升幅度相似，这可能是因为砷胁迫时，促进了黄芩细胞的氧化应激反应，促使苷类化合物生成苷元类化合物以抵御胁迫。无机元素不仅能够提供药用植物根系所需要的营养来影响植物代谢活动以及生长发育，而且也是黄芩药用活性成分的重要组成部分［35］。孟庆华等［36］的研究表明，适当增加或减少土壤中Zn2+、Mg2+两种离子的浓度可促进黄芩生物量的积累，Zn2+能够有效促进黄酮苷的合成，而Mg2+的作用相反。

2.4.2 营养胁迫的影响 营养缺乏会严重影响植物的生长速度和产量。魏东华等［37］的研究表明，施加复合肥的效果远好于不施肥组和单一施肥组，并且N1P3K3和N2P3K1效果最好。表明磷肥对于黄芩苷的积累影响较大，磷能够促进植物光合作用产物的合成与运输，并且释放能量促进各类化学反应的正常进行。曹鲜艳等［38］的研究发现，随着施肥水平的不断提高，可能会引起黄芩初生代谢产物大量增加，稀释了黄芩苷的含量，黄芩苷含量增幅明显降低，造成了黄芩苷含量先降低后升高。而施肥量持续增加，反而会导致黄芩产量减少。碳水化合物除了作为重要的能量来源，也能够影响初级和次级代谢［39］。在Park等［40］的研究中，采用不同碳水化合物培养黄芩，以确定适合黄芩黄酮类化合物合成积累的最佳碳源，结果表明，蔗糖能够促进黄芩生长以及有利于黄芩素的积累，果糖是黄芩苷合成的最佳碳源，半乳糖对汉黄芩素的促进作用最大。

3 小结

黄芩生长过程中遭受胁迫时，会引起机体的一系列反应。在黄芩的表观性状和生长发育上会引起植株矮小、叶片枯黄等。对于黄芩体内生理特性会通过激活抗氧化酶活性、合成黄酮类次生代谢产物、调节细胞渗透平衡等方式清除体内过剩的活性氧以抵抗胁迫。但是，也有研究表明在适当程度的环境胁迫下，有利于体内次生代谢产物的积累，从而提高黄芩的药用价值。

目前，对于黄芩面对环境影响的研究主要集中在水分、光照、温度、土壤条件等单一因素的讨论上，而对于复合胁迫的报道很少。因此，进行一些贴近黄芩道地产区环境的复合胁迫研究能够更好地了解环境胁迫对黄芩生长发育和次生代谢产物合成的影响。黄芩对胁迫的响应机制主要集中在表观形态、抗氧化酶、合成关键酶等的探讨上，对于黄芩次生代谢产物在基因、转录方面调控机制的探究不够全面。进一步探究黄芩响应环境胁迫的作用机制，有利于提高黄芩次生代谢产物、优选优良的抗逆品种，为黄芩栽培提供指导。