碳质材料载体对微生物的固定化作用及其在环境污染控制中的应用

韩 杰，蔡元奇，李 欣，翟 旻，黄明华，孟 军

（沈阳农业大学a.动物科学与医学学院，b.农学院/水稻研究所/国家生物炭研究院/农业农村部生物炭与土壤改良重点实验室，沈阳 110161）

近年来，微生物的生物降解作用已被广泛应用于生物制药、环境保护、农业生产、食品工程等领域。由于微生物活性受外界环境因素影响较大，使得直接应用游离微生物面临诸多挑战。微生物固定化技术是通过一定的物理或化学方法将微生物固定于载体上并被限制在一定的空间内从而保持其生物活性的一种新型技术。该技术不但提高了单位体积内微生物数量，其载体还为微生物提供营养物质和庇护空间，使微生物对环境干扰具有更高的抗性，有效缓解了传统技术中游离微生物单独作用所面临的生物活性和生物降解效率低下等问题，从而成为生物工程领域的研究热点。

固定化载体是影响微生物固定化技术发挥作用的核心因素。其根本作用是在生物相容性前提下为固定化微生物营造良好的空间和环境，通过影响微生物活性、微生物的生长代谢、微生物的生物量、固定化产物的使用成本、效率、结构、传质、强度及使用寿命等进而影响固定化产品的使用效果及工程应用[1]。目前固定化微生物载体主要面临的生物相容性差、微生物负载效率低、载体成本较高等关键问题已经成为制约该技术应用的瓶颈。近年来，基于碳质材料固定化微生物载体的开发与研究正在致力于推进上述问题的解决。本研究通过对碳质材料的性能特点和应用效果等方面进行综述，以期为在微生物固定化技术中全面了解和使用碳质材料提供参考。

1 固定化微生物载体种类和特性

固定微生物的效果因固定化载体材料的结构和性质不同而有较大差别。生产上对载体材料的总体技术和质量要求是：载体制备的原材料来源广泛且价格低廉、载体材料无毒性且单位空间承载微生物的密度大、性能稳定且固定化操作简单易行、回收和再利用性能好等。目前，常见的固定化微生物载体材料按照化学性质分为无机载体材料、有机载体材料和复合载体材料，其涵盖的种类和各种类优缺点见表1。此外，利用酸、碱、金属氧化物、表面活性剂等化学试剂对上述常见载体材料进行针对性的改性处理，可以获得固定化性能及使用效果更好的新型载体，此类研究主要集中于对生物炭、活性炭、沸石和硅藻土等无机载体的改性。同时，针对有机和无机载体材料的优缺点，将二者联合应用，相互取长补短，获得综合性能更加优越的载体材料也成为当前研究的热点。可见，目前对固定化载体的研究已经从使用单一载体材料逐渐向研制新型的改性材料和复合材料的方向发展。

表1 常见的载体材料种类及其应用的优缺点Table 1 Common types of carrier materials and their advantages and disadvantages

2 碳质材料载体在微生物固定化技术中的应用

近年来新的研究发现，碳质材料可以作为微生物固定化的理想载体。其高稳定性被认为是推进微生物固定化和递送微生物的一种颇有前景的材料。生物炭、活性炭、碳纳米管和石墨烯及其衍生物是应用最为广泛的碳质材料。它们普遍具有不溶性、高机械强度、良好的孔隙度、较大的比表面积和可以修饰调节的表面功能，有利于微生物在材料表面附着和生长以及在其内部繁殖和发育，为承载微生物奠定了良好的基础。

2.1 生物炭

生物炭是生物残体在缺氧条件下经高温慢热解（通常为300～700 ℃）产生的一类稳定的高度芳香化富碳固态物质[9]。其具有的多孔结构为微生物提供了适宜的栖息环境，高孔隙率和高阳离子交换效率有利于较长时间保留水分和养分以满足微生物生长发育的需求[10]。其含有的大量芳香族物质和官能团使其可以同时吸附阴、阳离子，还能与微生物表面官能团形成共价键牢固的固定微生物。

2.1.1 生物炭固定化微生物在环境污染物去除中的应用 目前，以生物炭为载体的微生物固定化技术的研究主要集中在环境保护和农业生产领域。其中以治理重金属和有机污染物为目的研究显示不同原料制备的生物炭固定化微生物对于污染物的去除均有良好的效果。采用玉米秸秆生物炭吸附法固定戴尔福特菌（Delftiasp.）B9（B-CSB）对被Cd和As污染土壤中的Cd2+和As饱和吸附量分别达到75.38 mg·g-1和34.03 mg·g-1，显著高于使用游离Delftiasp.B9菌时的饱和吸附量（49.43 mg·g-1和24.67 mg·g-1），而且添加B-CSB 能提高土壤中残渣态Cd和As含量，使可溶态含量显著减少[11]。表明玉米秸秆生物炭负载微生物能够有效修复被Cd和As污染的土壤。通过吸附法用芦苇生物炭固定化石油烃优势降解菌修复被石油烃污染的土壤40 d后，使石油烃去除率达55.01%[12]，表明芦苇生物炭负载能够去除石油烃污染物。采用竹炭吸附法固定壬基酚降解菌，7 d 后能使初始浓度30，50，80，100 mg·L-1的壬基酚降解率分别达到100%、75.3%、67.3%和78.7%，显著优于使用游离菌时的54.2%、51.5%、30.6%和23.5%；经过8轮重复利用后，竹炭固定菌对壬基酚降解率仍可达36.5%，而游离菌仅为8.9%[13]。表明竹炭固定化微生物能有效降解壬基酚污染物，且表现出良好的重复使用性。以稻壳、棉杆、秸秆、杉木和竹子为原料制备的五种生物炭负载多环芳烃（PAHs）降解菌对PAHs 污染土壤的修复效果均高于单一生物炭和游离菌，说明生物炭强化了微生物修复的效果[14]。

研究表明，一些生物炭经改性后或与其他载体复合后形成的微生物固定化体去除污染物效果显著提高。NaOH 改性的稻壳生物炭比改性前pH 和pHpzc（表面零点电荷点）分别提高1.76和1.61，采用吸附法对恶臭假单胞菌N3（MN602471）吸附量较改性前增加129.77 nmol·g-1，且采用吸附法制备的改性炭的固定化体更有利于氨氮废水中氨氮的去除和N3 活性恢复[15]。用MgCl2改性的生物炭灰分和酸性官能团含量升高，采用吸附法将其与石油烃和PAHs 降解菌形成的固定化体能显著去除石油烃和PAHs 污染物，有利于降解菌修复受污染的土壤[16]。在含Cr6+的土壤修复实验中，采用包埋法将蒙脱石磁铁矿和生物炭的复合载体与Cr6+降解菌形成固定化体30 d 后对土壤中浓度为25，50，100 mg·kg-1Cr6+去除率分别为88.37%、74.13%和48.85%，比游离菌高出26.06%～32.31%；30 d 后蒙脱石磁铁矿-生物炭固定化小球中的活菌数量显著高于未添加蒙脱石磁铁矿-生物炭固定化小球[17]。表明以蒙脱石磁铁矿-生物炭为载体的包埋技术有利于微生物存活和发挥生物学作用，并且蒙脱石磁铁矿提高了生物炭的稳定性和对污染物的吸附性。采用包埋法以聚乙烯醇和海藻酸钠为壁材包埋生物炭与磷酸盐溶解细菌（PSBs）和纳米零价铁的固定化体制成的胶珠，与游离菌相比包埋体中的菌种显示出更高的活性。胶珠平均表面积显著高于生物炭，更利于PSBs生长发育。对Pb2+的去除效率（84.54%）也远高于单一的生物炭（1.33%）[18]。可见，生物炭负载微生物后能更好去除污染物，针对生物炭的改性和以生物炭为核心的复合载体的开发有望更好地提高其对污染物的去除效率。

2.1.2 生物炭固定化微生物在土壤改良中的应用 在土壤改良中应用生物炭固定化技术主要以治理受污染和贫瘠土壤性能为主要目的。氯化铁改性的海带渣生物炭增加了PAHs污染土壤的有机质、铵态氮、有效磷和速效钾含量，且增加了土壤中对PAHs有良好适应和降解能力的优势功能微生物数量[19]。鹿粪生物炭耦合菌群HHP-3X制备复合菌剂能改善土壤酸化程度，增加土壤肥力[20]。以小麦秸秆生物炭为载体固定硫酸盐还原菌，能使土壤速效磷和速效钾含量分别提升37.86%和57.29%，土壤蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性分别得到显著改善[21]。使用莎草科植物制备的生物炭吸附并固定耐盐好氧反硝化细菌能明显改善潮汐流人工湿地处理含盐废水的脱氮能力[22]。此外，生物炭固定化功能菌剂对沙化土壤[23]和西北干旱矿区土壤[24]有机质、有效氮磷等养分含量以及土壤菌群多样性与群落功能均有明显的改善作用。

2.1.3 生物炭在固定化菌肥中的应用 在农业生产中，生物炭在维持菌肥中菌种活性上也具有良好的效果。如利用松木炭、麻秆炭、玉米秆炭作为吸附载体制备的炭基木霉NJAU 4742菌肥，保存7～30 d时菌肥中有效活菌数均有所增长，且在30 d时有效活菌数达到最大。其中松木炭和麻秆炭制备的菌肥在保存30 d时有效活菌数均高于初始活菌数[25]。以生物炭为载体包埋固定米曲霉抑制黄曲霉产毒，生物炭与秸秆粉和高岭土载体相比，显示出更好的缓释效果，而且提高了固定化微球的包埋率和机械强度[26]。

值得注意的是生物炭含有的多环芳烃、挥发性有机物、环境持久性自由基和重金属等对微生物生长代谢活动具有抑制作用[27]。因此，合理控制裂解温度，选择具有边缘毒性或无毒性的合适生物炭作为微生物固定化载体在生产应用中具有重要意义。此外，生物炭的量化生产成为其大规模应用的阻碍。

2.2 活性炭

活性炭是由木质、煤质和石油焦等含碳原料经热解、活化加工制备得到的一种特异性吸附能力较强的材料[28]。活性炭具有多孔结构、比表面积大、较强的吸附性等特点，能够承载更大密度的微生物。丰富的官能团有利于活性炭与微生物以共价键牢固地结合；性质稳定且细胞毒性低的特点使其成为固定化微生物的优良载体。生产材料来源广，成本较低，具有良好的经济前景，被广泛研究用于微生物固定化。

2.2.1 活性炭固定化微生物在重金属治理中的应用 活性炭微生物固定化技术在环境重金属去除方面有较多应用。将耐砷细菌通过吸附法固定在颗粒活性炭上能显著提高As5+和As3+的去除率，耐砷细菌能够产生砷酸还原酶将As5+还原为As3+，继而将As3+结合在耐砷细菌产生的特定蛋白（如ArsR）的活性位点上，从而对As5+和As3+进行去除。通过研究还发现耐砷细菌-活性炭固定化体能够同时去除几种重金属(如Fe3+、Mn2+、Cu2+和Zn2+)，去除效率分别达到65.2%、72.8%、98.6%和99.3%[29]。采用粉末活性炭吸附法固定化酵母能够对Cd 污染进行降解，活性炭表面的活性位点和官能基团能够与Cd2+结合，有助于Cd2+的降解。用粉末活性炭负载酵母对Cd2+的去除效率显著高于单一的活性炭[30]。

2.2.2 活性炭固定化微生物在有害气体治理中的应用 采用吸附法在活性炭上固定化甲烷氧化细菌制成的生物过滤器表现出良好的甲烷氧化效率，该作用是单独使用甲烷氧化细菌的4 倍[31]。采用吸附法固定在活性炭上的硫化物氧化细菌可以作为在生物过滤系统中处理硫化氢气体的有效材料，由于吸附和生物氧化的协同作用，固定化细菌对硫化氢的去除效率超过90%，显著高于单独的活性炭或细菌[32]。除此之外，活性炭作为载体可以刺激硫化物氧化细菌的生长，缩短它们在生物过滤系统中的驯化期，有利于硫化氢的氧化。且固定化细菌后活性炭治理硫化氢的寿命也会相应延长[33]。可见，活性炭多以吸附法固定微生物，且负载微生物后形成的固定化体对污染物去除效果要显著好于单独使用活性炭或微生物。

2.2.3 活性炭固定化微生物在养殖废水净化和食品工程中的应用 活性炭负载微生物在农业发展中净化水产养殖废水的作用效果显著。以活性炭为载体吸附光合细菌和有益菌坚强芽孢杆菌y5处理养殖废水48 h后，水中COD、氨氮、亚硝态氮及硝态氮含量均明显降低。将处理48 h后的废水倒出后加入未处理的养殖废水，观察混合菌固定化体系的后续处理效果，结果表明依然具有较好的处理效果，表明活性炭负载微生物可以应用于水产养殖中改善水质，且在实际生产中可以循环使用[34]。在食品工程中，活性炭负载微生物可用于食品增鲜。采用聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭作为壁材的包埋法对工程化大肠杆菌进行固定化可以有效保持基因工程菌大肠杆菌的酶活力和机械稳定性[35]。

综上所述，活性炭作为载体固定化微生物在生产实践中应用广泛，综合性能较为优良。且其本身极强的吸附性为污染物的去除提供基础，可以忽略的毒性使其可以应用在食品工程领域。由于活性炭和生物炭的性质较为接近，在应用过程中二者可以相互参照。

2.3 碳纳米管

碳纳米管是由具有sp2杂化结构的石墨片层卷曲而成的工程碳纳米材料。可以分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。碳纳米管具有较大的比表面积、较好的蛋白质亲和力和较高的机械强度等特性，为其承载微生提供了巨大优势。此外，碳纳米管极高的长径比、分子光滑的疏水石墨壁和纳米级内径有助于微生物更好附着在碳纳米管上[36]。碳纳米管的快速电极动力学和精细的电导率可以促进微生物和污染物之间的电子转移，有助于污染物的去除[37]。

碳纳米管负载微生物在环境保护领域应用广泛，且主要集中在重金属污染物的去除方面。采用多壁碳纳米管、海藻酸钠和聚乙烯醇包埋法固定化铜绿假单胞菌，固定后对胶珠进行冷冻以提高机械强度，将胶珠置于80 mg·L-1的Cr6+中时，固定化细菌在84 h 内减少50%，但在此浓度下游离细胞失活；把浓度降低将胶珠置于50 mg·L-1的Cr6+中时，胶珠可以重复利用9次，前5次还原效率在90%以上，最后还原效率在65%以上。并且研究发现微生物分泌的还原酶介导的细胞外还原和碳纳米管诱导的细胞内电子向Cr6+的加速转移可以促进Cr6+的还原[38]。该实验证明碳纳米管固定化微生物可以提高细菌对Cr6+的耐受性，使细菌得以重复利用。采用海藻酸钠和碳纳米管包埋法固定化希瓦氏菌Mr-1，与游离细胞和不含碳纳米管的细胞珠相比，海藻酸钙珠-碳纳米管-细胞胶珠对Cr6+的还原率高出4倍，主要归因于碳纳米管增强了电子转移，而且碳纳米管的加入极大地提高了胶珠的稳定性，这可以使海藻酸钙珠-碳纳米管-细胞胶珠的重复使用具有很高的可行性[39]。碳纳米管可多次重复使用的特性，可以大大提高其利用率。用碳纳米管、海藻酸钠和蒽醌-2、6-二磺酸盐（AQDS）包埋法固定化铀还原菌地杆菌、假单胞菌和芽孢杆菌用于去除铀污染，向20 mg·L-1的U6+中加入含有0.7%AQDS-碳纳米管的AQDS-碳纳米管-铀还原菌胶珠后，在8 h 内对U6+去除率超过97.5%，而单独的细菌对U6+去除率小于50%，表明碳纳米管包埋微生物对U6+去除效果显著[40]，碳纳米管固定化微生物对放射性元素污染有一定的修复作用。

可见，在污染物去除的应用中碳纳米管往往与其他载体配合使用。但值得注意的是，纳米毒理学研究发现碳纳米管具有一定的毒性，且其具有生物不可降解性，所以应该密切关注其在使用过程中产生不良因素的影响。除此之外，碳纳米管的产能较低也限制了其作为固定化微生物载体的应用范围。

2.4 石墨烯及其衍生物

石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道构成的二维层状碳纳米材料[41]。其结构上为纳米级厚度的薄片，具有相当高的表面积。夹层的纳米碳结构可容纳更多的细胞，且易于薄片表面和微生物细胞间形成大量的化学键，使微生物更好地吸附在石墨烯表面，提高固定化微生物的负载效率[42]。石墨烯还能有效的与蛋白质和低分子量生物调节剂相互作用，为微生物的生长发育提供良好的环境[43]。此外，石墨烯的衍生物氧化石墨烯和还原氧化石墨烯具有很高的机械强度，较大的比表面积，丰富的表面官能团，优异的导电性和独特的二维结构，被广泛应用作为微生物固定化载体[44]。

石墨烯负载微生物主要应用在环境保护领域用于污染物的去除。石墨烯复合微生物菌剂能够明显促进土壤中多环芳烃的微生物降解效率。研究表明以石墨烯和海藻酸钠为壁材包埋法固定HPD-2 菌制成的微珠与高浓度多环芳烃土壤共培养35 d 后，对原土中12 种多环芳烃的总降解率高达70.31%；复合微生物菌剂明显增加了土壤中细菌群落数量，提高了土壤中芘双加氧酶基因和多环芳烃降解相关的功能基因的丰度[45]。通过自由基聚合方法将甲基丙烯酸和甲基丙烯酸丁酯共聚物修饰到氧化石墨烯表面，并通过改性石墨烯表面的官能团将脱氮副球菌进行固定，形成新的固定化微球。该微球集吸附与降解于一体，在10，14 h内即可实现初始浓度1 000，2 000 mg·L-1的N，N－二甲基甲酰胺（DMF）溶液的完全处理，并不需经任何处理，在3 次循环使用后，对高浓度DMF（2 000 mg·L-1）的去除率仍可达到100%[46]。用氧化石墨烯溶液培养腐败希瓦氏菌CN32，开发了自组装生物还原氧化石墨烯水凝胶（BGH），结果发现，CN32-BGH 可以在20 h内将Cr6+还原为Cr3+，而且固定化细胞对Cr3+的还原率和去除效率远远高于悬浮细胞[47]。用还原性氧化石墨烯吸附法固定洋葱伯克霍尔德氏菌能够对孔雀石绿进行生物降解60 h 后孔雀石绿去除率达到98.5%，显著高于单独培养细胞的去除率87.7%[48]。上述说明石墨烯固定化微生物在污染物去除方面效果显著。

石墨烯依靠物理吸附、静电吸引、沉淀或化学反应等能够吸附水中的重金属离子、放射性元素和阴离子等无机污染物；对污水中的有机污染物可以通过范德华力、π-π 键、静电作用、氢键、阴离子-阳离子作用等将它们去除[49]。这使得石墨烯负载微生物在污染物去除方面具有广阔的应用前景。但是，值得关注的是石墨烯锋利的边缘可能会对细胞造成物理损伤，而且有研究表明石墨烯能诱导ROS 活性氧水平升高[50]。石墨烯覆盖在细胞表面还可能对传质效率造成影响[51]。除此之外，产能问题且具有一定的毒性阻碍了石墨烯作为固定化载体的发展。针对产能和毒性问题研发新的石墨烯衍生物和石墨烯复合载体是加强石墨烯应用的切入点。

3 展望

为长效保持微生物初始特性和功能，载体固定化微生物技术被认为是制备微生物制剂一个很有前途的发展方向。碳质材料本身的结构与功能成为其作为固定化载体的基础，在结构方面，碳质材料以其高稳定性，较大的比表面积，丰富的含氧官能团等诸多特性使其具有巨大优势，被认为是一种较为理想的固定化载体。在功能方面碳质材料具有较大的传质率，较高的生物亲和力以及兼容性使其能够为微生物的增殖和发育提供优异的环境。并且碳质材料丰富的官能团（如羧基、胺、羟基、磷酸盐和巯基）通过静电相互作用、阳离子-π 相互作用、离子交换、表面络合和沉淀作用有效提高了污染物的去除效率。

目前，基于碳质材料载体的微生物固定化技术仍需从4 个方面加强研究：（1）采用包埋法的微生物固定化技术对载体的成型性能、传质性能和机械强度等要求较高。在满足承载微生物密度和生物活性要求的基础上，应该加强载体的改性研究或者单一载体的配伍以获得生产实际所需的特定性能的新型载体。（2）单一载体往往难以满足生产中对固定化复合物多性能的需要，在国家绿色可持续发展理念的指引下，挖掘以农业废弃物为原料的生物炭等绿色载体的研究与开发，不断优化固定化配方和制备条件，同时在改性、功能化、缓慢可控等方面加强工程应用研究。（3）环境污染物种类繁多，性质各异，应该加强针对单一或同时针对多种污染物防治的碳质材料固定化微生物的多样化和专用化产品开发。加强碳质材料物理化学结构与污染物分子性质内在关系研究。（4）加强各种碳质材料的制造原料的开发，同时在制造技术上向大型化、自动化、连续化和无公害方向转化。在载体的微细结构、孔径分布和理化性质等方向加强研究，使碳质材料载体的应用领域从环境污染物防治向有机溶剂回收、公害防治等方向延伸。