COMMD7 在脑低级别胶质瘤发生发展中作用机制的生物信息学分析

王小燕, 胡溢洪, 韩语诚, 邹先琼

（1.桂林医学院智能医学与生物技术学院实验教学中心，广西 桂林 541199；2.广西高校生物化学与分子生物学重点实验室，广西 桂林 541199；3.桂林医学院智能医学与生物技术学院生物医学工程教研室，广西 桂林 541199）

美国中央脑瘤登记处数据［1］显示：神经胶质瘤是仅次于脑膜瘤，为第二常见的原发性颅内肿瘤，占所有原发性脑肿瘤的15.6%，占原发性恶性脑肿瘤的45.2%。脑低级别胶质瘤（lowergrade glioma，LGG）是一种起源于中枢神经系统的支持胶质细胞的高度异质性的神经胶质瘤，是中枢神经系统最常见和最具侵袭性的恶性肿瘤之一，占所有中枢神经系统恶性肿瘤的45.2%，占所有原发性中枢神经系统恶性肿瘤的80.0%［2］。目前的标准治疗方法主要有最大限度的手术切除、体外放射治疗和化疗［3-4］，但对其靶向标志物研究甚少，而靶向药物的开发有助于LGG 患者的个体化治疗，因此，识别更好的生物标志物已成为目前的挑战之一。新的生物标志物可能有助于更好地理解LGG的分子基础，可能在LGG 诊断、预后、胶质瘤残余监测和治疗反应预测以及靶向药物的开发中发挥重要作用。COMM 域包含蛋白质7 （COMM domain-containing protein 7，COMMD7）是COMMD 家族成员之一，由一个保守和独特的基序定义，称为铜代谢基因MURR1（COMM）结构域，位于人类20q11.21 染色体上，与多种人类实体肿瘤进展有关［5］。COMMD7 基因在胰腺导管腺癌细胞中高表达，与胰腺导管腺癌患者预后不良相关；在人类胰腺导管腺癌细胞系中，抑制COMMD7 基因的表达可诱导应激条件下的抗肿瘤作用［6］。COMMD7 基因高表达促进了肝癌细胞的增殖［7］，COMMD7 基因沉默可抑制肝癌细胞迁移和 侵 袭［8］。COMMD7 通 过 与 核 因 子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）的调节蛋白相互作用，从而 参 与NF-κB 信 号 的 终 止［6］，其 错 误 调 控 与 多 种肿 瘤 有 关［6，9］，COMMD7 在 原 发 性 肝 细 胞 癌 的NF-κB 信号通路中发挥了双重调控作用，一方面COMMD7 基因沉默可以抑制NF-κB p65 从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并且NF-κB 的沉默又会抑制COMMD7 基因的表达，进一步抑制细胞增殖；另一方面COMMD7 基因通过激活信号传导及转录激活蛋白4 （signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）蛋白抑制剂正向调控NF-κB［9］。此外，COMMD7 高表达还与急性髓系白血病的不良预后相关［10］。目前，COMMD7 基因在LGG 中的表达及其预后价值尚不清楚。本研究旨在分析COMMD7 基因的表达水平与LGG 预后之间的关系，以期寻找LGG 新的治疗靶点，为进一步探究LGG 癌变发生和发展的潜在分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据获取及处理从UCSC 基因组数据库网站（https：//xenabrowser.net/datapages/）下载癌症基因组数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中的523 个LGG 样本的RNA 测序数据以及基因型和基因表达量关联数据库（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）中的1 152 个正常样本的转录组RNA 测序数据及相应的临床信息。将FPKM 格式的RNA-Seq 基因表达数据转换为TPM 格式，并进行log2转换，以进一步研究。

1.2 COMMD7 在LGG 样本和正常样本中表达差异及差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）鉴定采 用Mann-WhitneyU检 验 分 析COMMD7 在523 例LGG 样本和1 152 名正常样本中的表达差异，以P< 0.05 为差异有统计学意义。将523 例LGG 样本分为COMMD7 低表达组和COMMD7 高表达组（以中位数为临界值），使用R 语 言 的DESeq 软 件 包［11］对COMMD7 低 表 达 组和 COMMD7 高 表 达 组 行 DEGs 鉴 定，以COMMD7 高表达组和低表达组间DEGs 表达量的比值，取以2 为底的对数的绝对值 |log2FC| > 1 且P<0.05 的DEGs 视为差异有统计学意义。

采用人类蛋白图谱数据库（The Human Protein Atlas，HPA）（www.proteinatlas.org）［12］验证COMMD7 蛋白在LGG 组织中的表达情况。在HPA 数据库中检索“COMMD7”得到在LGG组织与正常颅内组织免疫组织化学检测结果。

1.3 COMMD7 与LGG 患者预后的关系采用R语言的pROC 软件包（1.17.0.1）对523 例LGG 样本和1 152 名正常样本进行受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析，以评估COMMD7 的转录表达在区分LGG 样本和正常样本的有效性，ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）值 范 围 在0.5～1.0 表 示50%～100%的辨别能力。

采用单因素和多因素比例风险（Cox）回归分析COMMD7 在不同LGG 亚型中的预后价值，并采用R 语言的ggplot2 软件包（3.3.3 版本）基于单因素和多因素Cox 回归分析结果构建森林图，以P< 0.05 为差异有统计学意义。采用R 语言的RMS 软件包（6.2-0 版本）和R 语言的Survival 软件包（3.2-10 版本），纳入变量世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分级、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变状态、1p/19q 共缺失状态、主要治疗结果、组织学类型和COMMD7，基于多因素分析结果构建预测模型的列线图（Nomogram）和预测模型的校准图（Calibration），患者1、3 和5 年生存率是通过从总点轴直线到结果轴绘制一条线来确定，灰色的对角线为理想情况，蓝色的叉代表每个点经过分层Kaplan-Meier 校正后的结果。

采用Cox 回归模型评价TCGA 数据中COMMD7 低表达组和与COMMD7 高表达组（以中位数为临界值）HCC 患者预后差异，以P<0.05 为差异有统计学意义。

采用GEPIA 数据库［13］（http：//gepia.cancerpku.cn/help.html）中 514 个 LGG 样 本 的COMMD7 表达谱数据，验证COMMD7 表达与LGG 患者预后关系（以中位数为临界值），以P<0.05 为差异有统计学意义。采用Oncolnc 数据库（http：//www.oncolnc.org/）中510 个LGG 样 本的COMMD7 表达谱数据进一步验证COMMD7 表达与LGG 患者预后关系（以中位数为临界值），以P< 0.05 为差异有统计学意义。

1.4 DEGs 的富集分析使用R 语言ClusteProfiler软件包（3.14.3 版本）［14］对以2 为底的COMMD7高表达组和COMMD7 低表达组间DEGs 表达量比值的绝对值|logFC|>1.5 和P<0.05 为阈值的DEGs 进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，获得DEGs 的分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞成分（cellular component，CC）等注释分析和通路富集分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。使用R 语言ClusteProfiler 软件包（3.14.3 版本）［14］以从分子签名数据库 （MSigDB）下载C2.cp.v7.0.symbols.gmt 作为基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）的目标集合，对DEGs 进行GSEA，获得DEGs 显著富集的基因集。每个分析将基因集排列1 000 次，以P<0.05 和错误发现率（false discovery rate，FDR）值<0.25 被认为差异有统计学意义。

1.5 免疫浸润分析采用TISIDB 网站（http：//cis.hku.hk/TISIDB）［15］评 估COMMD7 表 达 与 免疫细胞浸润水平、免疫检查点、免疫刺激因子和趋化因子之间的相关性。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 COMMD7 基因在LGG 样本和正常样本中表达差异及DEGs 的鉴定Mann-WhitneyU检验分析结果显示：与正常样本比较，COMMD7 基因在LGG 样本中的表达明显上调（图1）。HPA 数据库的分析结果显示：COMMD7 基因在LGG 样本中的表达明显上调（图2）。COMMD7 低表达组和COMMD7 高表达组中发现764 个DEGs，包括654 个上调DEGs 和110 个下调DEGs（图3）。

图1 COMMD7 在正常样本和脑LGG 样本中的表达（TCGA 数据库）Fig.1 Expressions of COMMD7 in normal samples and brain LGG samples（TCGA Database）

图2 COMMD7 在正常样本和脑LGG 样本中的表达（HPA 数据库）（Bar=200 μm）Fig.2 Expressions of COMMD7 in normal samples and brain LGG samples（HPA Database）（Bar=200 μm）

图3 DEGs 的火山图Fig.3 Volcano plot of DEGs

2.2 COMMD7 与LGG 患者预后的关系森林图结果显示：COMMD7 基因表达水平与WHO 分级、IDH 突变状态、1p/19q 共缺失状态、主要治疗结果和组织学类型等亚型呈明显正相关关系（P<0.05）（图4）。预测模型列线图显示：COMMD7基因表达水平越高，对预测模型的贡献越大，患者1、3 和5 年生存率越低（图5A），预测模型列线图的校准图显示患者1、3 和5 年的实际生存率线与理想情况灰色线贴近，证实了该列线图预测的准确性（图5B），COMMD7 是LGG 的独立预后因素。ROC 曲线分析结果显示：COMMD7 用于区分癌组织与癌旁组织具有较高的诊断价值（AUC=0.835，95%CI：0.816～0.853）（图5C）。Cox 回归分析结果显示：COMMD7 高表达组LGG 患者的生存率明显低于COMMD7 低表达组（P<0.001），表明COMMD7 高表达与LGG 患者的预后不良有明显关联（图6A）。GEPIA 数据库和Oncolnc 数据库的数据分析结果显示：COMMD7高表达组LGG 患者的生存率明显低于COMMD7低表达组（P=0.003，P=0.006）（图6B 和6C）。

图4 Cox 回归分析结果Fig.4 Results of Cox regression analysis

图5 预后预测模型和ROC 曲线Fig.5 Prognostic predition model and ROC curve

图6 COMMD7 高表达组和COMMD7 低表达组脑LGG 患者生存曲线图Fig.6 Survival curves of brain LGG patients in high expression of COMMD7 group and low expression of COMMD7 group

2.3 DEGs 的富集分析GO 功能富集分析结果显示：与BP 关联显著富集的共有71 条，其中前3 条分别是模式规范过程（GO：0007389）、区域化（GO：0003002）和 前/后 模 式 规 范 （GO：0009952）（P<0.05）；与CC 关联显著富集的共有5 条，其中前3 条分别是高密度脂蛋白（GO：0034364）、血浆脂蛋白颗粒（GO：0034358）和血浆脂蛋白粒子（GO：0034358）（P<0.05）；与MF 关联显著富集的共有36 条，其中前3 条分别是DNA 结合转录激活子活性/RNA 聚合酶Ⅱ特异性（GO：0001228）、增强子序列特异性DNA 结合（GO：0001158）和增强子绑定（GO：0035326）（P<0.05）。KEGG 生物通路富集分析结果显示：显著富集的通路仅有1 条（P<0.05），为癌症中的转录失调通路（hsa05202）（图7A）。

GSEA 分析结果显示：与KEGG 数据库中细胞周期（N=1.950，P=0.012）（图7B）、WP数据库中细胞周期（N=1.944，P=0.012）（图7C）、G2/M 检查点（N=2.118，P=0.001）（图7D）和G2/M DNA 损 伤 检 查 点（N=1.879，P=0.012）（图7E）密切相关的基因集在COMMD7 高表达LGG 样本中显著 富集（P<0.05）。COMMD7 高表达与肿瘤密切相关的p53 稳定有关（N=1.793，P=0.012）（图7F），可以激活p53 下游通路（N=1.782，P=0.012）（图7G）和p53 信号通路（N=1.762，P=0.012）（图7H），激活Tp53调控细胞周期基因的转录（N=1.766，P=0.018）（图7I）。

图7 COMMD7 低表达组和COMMD7 高表达组之间的DEGs 的富集分析Fig.7 Enrichment analysis of DEGs between low expression of COMMD7 group and high expression of COMMD7 group

2.4 COMMD7 基因表达与LGG 免疫细胞浸润的关系应用TISIDB 数据库数据进行Spearman 相关性分析，结果显示：COMMD7 基因表达水平与活化的CD8+T 淋巴细胞、中枢记忆CD8+T 淋巴细胞和CD56bright自然杀伤细胞等15 种细胞数量呈明显正相关关系（P<0.05），与活化的B 淋巴细胞和记忆B 淋巴细胞数量呈明显负相关关系（P<0.05）（图8A～8F）。COMMD7 基因表达水平与吲哚胺2，3-加双氧酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）、半 乳 凝 素9 （galactin 9，LGALS9）和CD244 等11 关键的免疫检查点基因表达水平呈明显正相关关系（P<0.05），与CD274 （PD-L1）、激酶插入区域受体（kinase insert domain receptor，KDR）和带有Ig 及ITIM 结构域的T 淋巴细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）表达水平呈明显负相关关系（P<0.05）（图8G～8M）。CD40、CD276 和CD48等8 个关键免疫刺激因子（图8N～8S）及C-C 基序趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、C-C 基 序 趋 化 因 子 配 体5 （C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）和C-X-C 基序趋化因子 配 体 9 （C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）等7 个免疫趋化因子（图8T～8Y）的表达水平与COMMD7 基因表达水平呈明显正相关关系（P<0.05）。

图8 COMMD7 表达与脑LGG 微环境中免疫浸润的关系Fig.8 Relationships between expression of COMMD7 and immune infiltration in brain LGG microenvironment

3 讨 论

COMMD7 与胰腺导管腺癌、肝细胞癌和急性髓 系 白 血 病 进 展 有 关［6，8，10］。本 研 究 结 果 显 示：COMMD7 在LGG 样本中明显高表达，基于单因素和多因素Cox 回归分析证明了COMMD7 是LGG独立的预后因素，构建了列线图和校准图，证明了COMMD7 对LGG 患 者1、3 和5 年 生 存 率 预 测 的

准确性，应用COMMD7 区分癌组织和癌旁组织具有较高的诊断价值，并采用多个数据库数据进行了验证，COMMD7 上调是LGG 患者的不良预后因子，且与LGG 的进展呈正相关关系，可作为LGG的预后预测因子。

本研究结果显示：在COMMD7 低表达组和COMMD7 高表达组之间明显差异表达的有764 个DEGs。GO-KEGG 功能富集分析结果显示：上述DEGs 的整体功能与转录有关，KEGG 通路为癌症中的转录失调通路，提示COMMD7 可能通过影响转录过程中的一些重要的细胞成分和酶的功能导致转录失调，进而对LGG 产生影响。GSEA 分析结果显示：与细胞周期、细胞周期中G2/M 检查点和p53 相关通路的DEGs 在COMMD7 高表达样本中明显富集。细胞周期与肿瘤的发生发展密切相关［16-18］，而周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的激活和失活可调控细胞周期进程［19］。研 究［20-22］表 明：CDKs 与 胶 质 母 细 胞 瘤 进展密切相关。细胞周期G2/M 检查点通过允许细胞在进入有丝分裂前修复DNA 损伤，在维持染色体完整性方面发挥重要作用［23］。肿瘤抑制因子p53 与细胞周期进展有密切关联，在肿瘤中诱导G2/M 阻滞［24-25］，上述结果提示COMMD7 可能通过与肿瘤发生发展密切相关的细胞周期相关通路、p53 相关通路和癌症中的转录失调通路来共同影响LGG 的发生发展。

肿瘤微环境中的免疫浸润在肿瘤发生发展中发挥关键作用，并影响肿瘤患者的临床预后［26］。随着肿瘤免疫治疗的兴起，胶质瘤免疫微环境的研究逐渐成为研究热点，在该领域取得了快速的进展［27-28］。非SMC-凝聚素Ⅰ复合物G 亚单位（non-SMC condensin Ⅰ complex subunit G，NCAPG）促进胶质瘤的肿瘤进展，调节免疫细胞浸润［29］；类波多坎 1（podocan like 1，PODNL1）甲基化可作为一种预后生物标志物，并与低级别胶质瘤中的免疫细胞浸润和免疫检查点阻断反应相关［30］。本研究结果显示：COMMD7 基因表达水平与多个免疫细胞的数量呈明显正相关关系。本研究中KEGG通路和GSEA 富集分析结果均显示上述DEGs 在与肿瘤密切相关的通路中显著富集，推测可能COMMD7 高表达组通过参与肿瘤信号通路诱导肿瘤细胞更容易发生免疫逃逸，从而影响LGG 的进展和预后。本研究结果还显示：COMMD7 基因表达水平与多个关键免疫检查点和免疫趋化因子表达水平有明显关联。COMMD7 与免疫检查点CD274的表达水平呈明显负相关关系，而CD274 可以促进肿瘤细胞脂质过氧化和铁死亡［31］。铁死亡是一种近期发现的由脂质活性氧的铁依赖性积累引起的调节细胞死亡的形式［32］。研究［33］表明：铁死亡是胶质瘤中最富集的程序性细胞死亡过程，可诱导免疫抑制和免疫治疗抵抗，且通过联合铁死亡与CD274 免疫检查点的实验结果表明铁死亡抑制剂铁抑素-1 与免疫检查点CD274 联用效果更佳。因此，推测COMMD7 高表达组可能通过抑制免疫检查点CD274 的表达来抑制LGG 铁死亡，从而影响LGG的进展和预后，COMMD7 可能在LGG 患者免疫检查点抑制剂治疗（immune checkpoint blockade，ICB）中发挥关键作用。

综上所述，本研究揭示了COMMD7 的高表达与LGG 患者不良预后有关。以往的研究往往局限于研究基因与癌症相关通路，而本研究不仅分析了COMMD7 可能作用于LGG 的通路，还结合了免疫治疗来共同探讨COMMD7 在LGG 治疗中可能作用，表明COMMD7 可能是免疫治疗的一个新的靶点，并可能与LGG 铁死亡有关，为LGG 治疗提供了新的思路。然而，COMMD7 与基因改变之间的调控机制及癌症相关的通路和免疫作用机制仍有待于进一步在胶质瘤细胞系和胶质瘤样本中验证确定。