转位蛋白配体XBD173 对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制

高兴洪, 唐红梅, 李月蛟, 王孝芸, 王 星, 袁谢芳, 吴 敏

（西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川 泸州 646000）

自1956 年RICHARD-DOLL 阐述了吸烟与肺癌高度相关［1］，吸烟的危害已经被广泛研究。烟雾暴露可参与机体多种疾病的发生发展，巨噬细胞在受到香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激时，可极化为M1 型巨噬细胞，分泌多种炎症因子，在CSE 诱导的肺部炎症反应中具有重 要 作 用［2］，转 位 蛋 白（translocator protein，TSPO）广泛分布于线粒体外膜，具有调节胆固醇转运、类固醇类激素合成、卟啉转运、血红素合成、细胞凋亡、细胞增殖、离子运输、线粒体功能调节和免疫调节等多种功能［3］。XBD173 为人工合成的TSPO 配体，研究［4］显示：XBD173 具有良好的抗炎作用和神经保护作用，但XBD173 对CSE诱导的肺炎症反应和巨噬细胞极化是否有作用及其可能机制，国内外尚未见相关报道。因此本研究以C57BL/6 小鼠和RAW264.7 细胞为研究对象，探讨XBD173 对CSE 所致小鼠肺部炎症反应和CSE诱导的巨噬细胞M1 型极化的影响及其可能分子机制，以期为吸烟者的肺炎症治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器18 只8 周龄SPF 级C57BL/6 雄性小鼠购于重庆腾鑫生物技术有限公司，动物使用许可证号：SYXK （川）2018-065，体质量（20±2）g。12 h 交替照明，温度保持在22 ℃～26 ℃，自由获取食物和水，按照《实验动物许可管理办法》和《实验动物管理条例》的相关规定进行实验；香烟（娇子牌）购自成都卷烟厂；小鼠Raw264.7 巨噬细胞购于中国科学院细胞库；血清购于澳大利亚Bovogen Biological 公司，高糖DMEM 培养基购于上海源培生物科技股份有限公司，XBD173 购于美国MedChemExpress 生物科技公司，CD80、CD86 和诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）流式抗体均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，凋亡检测试剂盒购于四正柏生物有限公司，逆转录试剂盒和逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒购于南京诺维赞生物科技有限公司，Western blotting 抗体GADPH、核因子κB/p65 （nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65）和磷酸化NF-κB/p65（phosphorylated NF-κB/p65，p-NF-κB/p65）均 购 于 美 国 Cell Signal Technology 公司，ECL 超敏化学发光试剂盒购自四正柏生物有限公司，TSPO 转染慢病毒、转染试剂和嘌呤霉素购于吉凯基因，HE 染色试剂盒、RIPA 裂解液和SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均购于碧云天生物技术公司。凝胶成像分析仪购自美国BIO-RAD 公司，Leica DM2000 显微镜购自德国Leica Microsystems 公 司，Centrifuge 5810R 离 心 机购自德国艾本德公司，Nano400 微量分光光度计购自北京原平皓生物技术有限公司，LightCycler480 Ⅱ实时荧光定量PCR 系统购自瑞士罗氏医学仪器公司。

1.2 CSE 制备参 照NAKAMURA 等［5］方 法 制备：将香烟烟嘴与泵连接，通过泵的抽气作用吸取香烟燃烧后的烟雾，按每支香烟烟雾溶解于2 mL PBS 液制成悬液。悬液经NaOH 调节pH 值为7.4，经孔径为0.2 μm 滤膜过滤除去细菌和大颗粒后备用。

1.3 实验动物分组、肺炎症模型制备及处理18 只小鼠随机分为对照组、CSE 组和CSE+XBD173 组，每组6 只。CSE 组和CSE+XBD173组小鼠给予CSE 滴鼻，每 次20 μ L，连 续28 d，2 次 间 隔24 h；在 第22～28 天，CSE+XBD173 组小鼠在CSE 刺激前0.5 h 给予10 mg·kg－1XBD173腹腔注射。第29 天处死小鼠。

1.4 HE 染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现处死小鼠后取新鲜肺组织，4%多聚甲醛固定20 h。脱水、透明、浸蜡和包埋，将包埋好的肺组织蜡块切片，厚度为4 μm，按HE 染色试剂盒进行后续步骤。染色完成后，显微镜下观察各组小鼠肺组织病理形态表现。

1.5 PAS 染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现 处死小鼠后取新鲜肺组织，10% 甲醛固定，石蜡包埋，2 μm 厚度切片后常规脱蜡至水，PAS染色后中性树胶封固。显微镜下观察各组小鼠肺组织病理形态表现。

1.6 RAW264.7 细胞TSPO 蛋白敲低和筛选将处于对数生长期的RAW264.7 细胞经细胞刮刮下，完全培养基制成细胞密度为（3～5）×104mL－1的细胞悬液，6 孔细胞培养板铺板，每孔2 mL，培养24 h 后，采用感染复数（multiplicity of infection，MOI）为20 的慢病毒感染RAW264.7 细胞以敲低TSPO 基因，培养12 h 后完全培养基换液继续培养，在完全培养基中加入2 mg·L－1嘌呤嘧啶筛选，当病毒载体上的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）阳性表达率大于80%时，收集细胞进行后续实验。TSPO 基因敲低序列，上游引物：5′-ACCATTGGGCC-3′，下 游 引 物：5′-CTGGTCTA-3′。

1.7 RT-qPCR 法检测各组RAW264.7 细胞中白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表达水平将实验处理后的细胞按照RNA 提取试剂盒说明书提取RNA；采用微量分光光度计测定总RNA纯度，检测RNA 样本在波长260 和280 nm 处的吸光度（A）值，控制A（260）/A（280）在1.9～2.1，RNA 电泳检测其完整性。检测浓度及纯度后取2 μg 总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录条件：37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。将逆转录所得cDNA 纯化后应用RT-qPCR 仪进行PCR 扩增。反应总体积为20 μL：2 μ L cDNA 模板，2 μ L 引 物，10 μL SYBR qPCR Master Mix，6 μL H2O。PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s，扩增循环95 ℃、5 s，56 ℃、34 s，共40 个 循 环。以β-actin 为 参 照，采 用2－ΔΔCt法 计 算IL-6 和TNF-α mRNA 相对表达水平。引物序列见表1。

1.8 Western blotting 法检测各组RAW264.7 细胞中NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表达水平细胞刺激结束后，吸去培养基，PBS 缓 冲 液 洗 涤1 次，加入200 μL RIPA 强裂解液，检测蛋白浓度；加入含SDS 上样缓冲液，煮10 min；进行SDSPAGE 凝胶配制，上样电泳；采用PVDF 膜转膜；5%脱脂奶粉进行封闭；按照抗体说明书稀释一抗，4 ℃过夜孵育。TBST 洗涤3 次，进行二抗孵育，4 ℃孵育2 h，TBST 洗涤3 次后，采用ECL 超敏化学底物试剂盒上机检测拍照分析；Image J 软件分析各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.9 流式细胞术检测各组RAW264.7 细胞CD80、CD86、iNOS 和ROS 表达水平将各组细胞分装入5 mL 流式细胞管内，离心细胞，弃上清，CD80、CD86 和iNOS 抗体用孵育缓冲液按照1∶1 000 稀释，加入100 μL 含抗体的孵育缓冲液，重悬细胞；在冰上孵育30 min。1 200 r·min－1离心5 min，弃上清液；加入100 μL 孵育缓冲液重悬细胞，使用流式细胞分析仪检测分析。ROS 按照试剂盒说明书检测。CD80 和CD86 表达水平以各组荧光阳性细胞数量占总细胞数百分比表示，iNOS 和ROS 表达水平以各组细胞的平均荧光强度表示。

1.10 流式细胞术检测各组RAW264.7 细胞凋亡率收集已处理好的细胞至离心管内，1 000 g 离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS 缓冲液轻轻重悬细胞并计数，取（5～10）×104个万重悬的细胞，1 000 g 离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 结合液轻轻重悬细胞；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混匀；加入10 μL 碘化丙啶染色液，混匀；室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测，按说明书分析。

1.11 统计学分析采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。各组细胞中CD80、CD86、iNOS 和ROS表达水平，IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平，细胞凋亡率，NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肺组织病理形态表现HE 染色和PAS 染色结果显示：对照组小鼠肺组织中支气管结构完整，肺泡腔结构清晰，肺泡壁厚度均匀，无增宽和渗出等现象，肺泡间隔无水肿、无炎症细胞浸润、无分泌物渗出。CSE 组小鼠肺组织中支气管管腔变窄，管壁增厚，有分泌物渗出，可见大量炎症细胞浸润，肺泡结构不完整。CSE+XBD173组小鼠肺组织中炎症表现减轻。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理形态表现（×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups（×200）

2.2 各组RAW264.7 细胞中M1 表面标志物CD80、CD86 和iNOS 表达水平与对照组比较，CSE 组RAW264.7 细 胞 中CD80、CD86 和iNOS 表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；与CSE组比较，CSE+XBD173 组RAW264.7 细 胞 中CD80、CD86 和iNOS 表 达 水 平 明 显 降 低（P<0.05）。见图2。

图2 流式细胞术检测各组细胞中CD80、CD86 和iNOS 表达水平Fig.2 Expression levels of CD80, CD86，and iNOS in cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各组RAW264.7 细胞中ROS 表达水平与对照组（19 290±2 906）比较，CSE 组RAW264.7细胞中ROS 表达水平（26 789±3 980）明显升高（P<0.05）；与CSE 组 比 较，CSE+XBD173 组RAW264.7 细胞中ROS 水平（20 120±4 114）明显降低（P<0.05）。

2.4 各组RAW264.7 细胞凋亡率与对照组（8.80%±0.42%）比较，CSE 组RAW264.7 细胞凋亡率（28.96%±1.73%）明显升高（P<0.05）；与CSE 组 比 较，CSE+XBD173 组RAW2647 细 胞凋亡率（22.94%±2.2%）明显降低（P<0.05）。见图3。

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各组RAW264.7 细胞中IL-6 和TNF-α mRNA表达水平与对照组比较，CSE 组RAW264.7 细胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P<0.05）；与CSE 组 比 较，CSE+XBD173 组RAW264.7 细 胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 达 水 平明显降低（P<0.05）。当RAW264.7 细胞TSPO蛋白敲低后，在TSPO KD+control 组、TSPO KD+CSE 组 和 TSPO KD+CSE+XBD173 组RAW264.7 细 胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 达 水 平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 RT-qPCR 法检测各组细胞中IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of IL-6 and TNF-α mRNA in cells in various groups detected by RT-qPCR method (n=3，±s）

表2 RT-qPCR 法检测各组细胞中IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of IL-6 and TNF-α mRNA in cells in various groups detected by RT-qPCR method (n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with CSE group.

TNF-α 1.09±0.13 1.61±0.22*0.65±0.14△1.00±0.10 0.91±0.06 0.75±0.13 Group Control CSE CSE+XBD173 TSPO KD+control TSPO KD+CSE TSPO KD+CSE+XBD173 IL-6 0.95±0.07 2.75±0.98*0.87±0.30△0.32±0.18 0.14±0.07 0.14±0.11

2.6 各组 RAW264.7 细胞中 NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白 表达水平3 组RAW264.7 细 胞中NF-κB/p65 蛋白表达水平比较差异无统计学意义 （P>0.05）；与 对 照 组 比 较，CSE 组RAW264.7 细胞中p-NF-κB/p65 蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与CES组比较，CSE+XBD173组RAW264.7 细胞中p-NF-κB/p65 表达水平明显降低（P<0.05）。见图4。

图4 Western blotting 法检测各组细胞中NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表达电泳图（A）及直条图（B 和C）Fig.4 Electrophoregram (A) and histograms (B，C) of expressions of NF-κB/p65 and p-NF-κB/p65 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

香烟是一种具有多重毒性的成瘾物，与全身多个器官的损害有关［6］。香烟烟雾对心血管具有严重的损伤作用，可表现为内皮功能障碍氧化应激增加、心血管发病率和死亡率增加等［7］。TSPO 首先由BRAESTRUP 于1977 年发现，被认为与外周的苯二氮卓类结合位点有高亲和性［8］。正常情况下，TSPO 在中枢神经系统中表达较低，仅限于星形胶质细胞和小胶质细胞，但当脑损伤或炎症时，其表达水平明显升高［9-10］。在急性肺炎模型中，TSPO可作为衡量炎症损伤的指标［11-12］。研究［13-14］表明：TSPO 配体XBD173 可有效缓解视网膜缺血模型中的神经退行性变，还可减轻视网膜色素上皮细胞的炎症反应。本研究结果显示：XBD173 可有效抑制CSE 诱导的肺部炎症反应。

巨噬细胞是重要的免疫细胞，其主要的功能包括：①吞噬病原体、感染细胞、碎片和死亡细胞；②呈递抗原；③分泌各种细胞因子［15］。当巨噬细胞受到刺激时，会极化为M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞，M1 型巨噬细胞作为一种促炎症细胞存在，主要参与体内的1 型辅助T 细胞（T helper 1 cell，TH1）介 导 的 免 疫 反 应，可 分 泌TNF-α、IL-1β、IL-12 和IL-6 等 炎 症 因 子［15-16］，M1 型 巨 噬细胞参与多种疾病的病理过程。在小鼠蛛网膜下腔出血模型中，TSPO 配体处理可降低小胶质细胞活化 和 增加抗炎因子的产生［17］，TSPO 配体2-（2-氯苯基）喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（2-Cl-MGV-1）和2-苯基喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（MGV-1）可降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小 胶 质 细 胞 炎 症 因 子TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达［18］。本研究结果显示：CSE 刺激使RAW264.7细胞增加M1 极化水平和细胞因子分泌，XBD173处理可抑制巨噬细胞M1 极化和细胞因子分泌，与小鼠肺组织的病理结果一致；而在TSPO 敲低组中，各组之间无明显变化，提示TSPO 对巨噬细胞功能起重要的调控作用。

ROS 既是一种重要的抗菌介质，也是重要的信号分子［19］，在细胞增殖、缺氧适应和细胞信号传递决定中起重要作用，但过量的ROS 会导致不可逆的细胞损伤甚至细胞死亡，许多疾病的发生和发展与ROS 生产过剩有密切关联［20］。在视网膜损伤模型中，XBD173 可降低巨噬细胞的吞噬能力，减少ROS 产生从而发挥保护作用［21］。本研究结果显示：XBD173 可抑制CSE 诱导的ROS 产生。细胞产生过量ROS 会导致细胞凋亡。本研究结果同时显示：XBD173 可抑制CSE 诱导的细胞凋亡水平。凋亡的巨噬细胞通过释放代谢产物和炎症因子，激活MAPK 信号通路，导致巨噬细胞M1 极化增加和炎性因子释放［22］。年龄相关黄斑变性模型的 研 究［13］结 果 显 示：XBD173 可 通 过NADPH 氧化酶2 （NADPH oxidase 2，NOX2）通路或钙离子减少ROS 的产生，降低小胶质细胞激活。研究［23］显 示：TSPO 可 与NOX2 亚 基gp91phox 和p22phox 结合，其机制可能与NOX2 通路相关。

NF-κB 于1986 年作为结合B 细胞的κ 轻链增强子 的 转 录 因 子 被 发 现［24］。NF-κB 家 族 是 真 核 转 录因子结构相关的蛋白家族，包括5 个成员：NF-κB1（p50 及其前体p105）、NF-κB2（p52 以及其前体p100）、RelA （p65）、c-Rel 和RelB，5 个成员在正常状态下通常在细胞质中与NF-κB 抑制因子（inhibitory of NF-κB，IκB）家族结合保持未激活状态，在其经典激活途径中，当受到相应信号分子刺激时，IκB 首先被磷酸化，继而降解，从而促使NF-κB 异二聚体（RelA-p50 二聚体）从细胞质中转移至细胞核，调控巨噬细胞向M1 型极化，进 而 促 进IL-1β、TNF-α 和IL-6 等 促 炎 因 子 的 释放［25-26］。研究［27］显示：NF-κB 通 路参与小胶质细胞炎症的激活。本研究结果显示：CSE 处理组细胞中p-NF-κB/p65 蛋白表达水平升高，而XBD173可降低其表达水平，提示XBD173 可能通过调节NF-κB 通路而发挥抗炎作用。

综上所述，TSPO 配体XBD173 可减轻CSE 诱导的小鼠肺部炎症反应，TSPO 可调控巨噬细胞M1 极化和炎症因子的产生，其机制可能与NF-κB通路有关，但其具体机制仍需进一步研究。本研究为XBD173 对香烟烟雾诱导的肺部炎症反应的保护作用提供了理论和实验依据，未来应进一步结合动物实验和临床试验探索XBD173 的炎症抑制作用机制，为香烟烟雾引起的肺部炎症的改善提供新思路。