基于斑马鱼模型的心血管疾病研究进展

刘晓金　李允江　张晓明　徐田芹　李娅宁

摘 要：目前，心血管疾病严重威胁着人类的生命健康，具有发病急、病死率高、复发率高等特点。斑马鱼因具有体积小、易饲养、繁殖快、胚胎透明、性成熟周期短、遗传基因与人类遗传基因高度相似等特点已被广泛应用于科学研究的各项前沿领域。近年来基于斑马鱼进行的降血脂、抗动脉粥样硬化、保护心脏、抗血栓、抗炎等研究，阐述了斑马鱼在治疗心血管疾病方面的藥物筛选和应用价值，可为治疗心血管疾病药物的开发提供一定的参考。

关键词：斑马鱼；心血管疾病；药物筛选

中图分类号：R285

文献标志码：A

Research progress of cardiovascular diseases based on zebrafish

LIU Xiaojin LI Yunjiang ZHANG Xiaoming XU Tianqin LI Yaning

（1. School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China;

2. Department of Pharmacy， Shandong Medical College， Linyi 276000， China;

3. Pharmacy Department， Pingyi County Hospital of Traditional Chinese Medicine， Linyi 273300， China）

Abstract： At present， cardiovascular disease is a serious threat to human life and health， with the characteristics of rapid onset， high mortality and high recurrence rate. Zebrafish has been widely used in various frontiers of scientific and technological researches because of its small size， easy breeding， fast reproduction， transparent embryos， short sexual maturity cycle， and high similarity of genetic genes to human genetic genes. During recent years， the studies of zebrafish model on hypolipidemic， anti-atherosclerosis， heart protection， anti-thrombosis， anti-inflammation， etc， explained the drug screening and application value of zebrafish in the treatment of cardiovascular diseases， which provided a certain reference for the development of drugs to treat cardiovascular diseases.

Key words： zebrafish； cardiovascular disease； drug screening

心血管系统疾病是与循环系统有关的一系列疾病，种类繁多、发病诱因复杂，是遗传因素和环境因素相互作用的结果，是对人类健康危害最大的疾病之一，给社会和家庭带来了沉重的经济负担。积极探索关于治疗心血管疾病的有效药物是降低发病率和病死率的最有效方式。

斑马鱼俗称“花条鱼”“蓝条鱼”等，是热带淡水硬骨鱼，其基因与人类基因的同源性较高，转基因资源丰富，科学研究品种众多。斑马鱼为卵生鱼类，易饲养，对水质要求不高，适宜水温为25 ℃左右，4个月大进入性成熟期，繁殖周期约为7 d，一对亲鱼每周可以产生约300枚受精卵，24 h内即可形成胚胎。斑马鱼胚胎透明，在96孔板中用显微镜可观察到其整个发育周期。

与传统实验哺乳动物相比，斑马鱼具有体型小、易饲养、性成熟周期短、繁殖能力强、体外受精发育、胚胎透明且培育周期短、遗传背景清楚、测试成本低等特点，实验操作便捷、高效[1]。斑马鱼作为一种脊椎动物的生物模型，与人类基因有87%的同源性[2]，某些疾病相关基因与人类基因的保守性高达99%，可以模拟人体的代谢过程，有助于体外实验结果与体内实验结果的结合，提高科学研究的效率和可信度。早在2003年，美国国立卫生研究院就将斑马鱼列为仅次于大鼠和小鼠的重要的实验生物，为无脊椎动物和小型哺乳动物提供了桥梁，被广泛应用于毒理学、药理学、基础医学、临床医学、药物研发及环境研究等多项研究领域（图1），成为目前科学研究的热门脊椎生物模型。

1 斑马鱼心血管系统的生长发育

斑马鱼胚胎透明适合在细胞水平上研究心血管系统疾病的发病机制。斑马鱼受精5 h后，心前细胞开始发育形成原肠，然后再形成外胚层、内胚层和中胚层；受精17 h出现心肌融合；受精22 h 2个心脏在胚胎中线处融合，形成了一个心锥向前延伸成一条直线心管；受精28 h线性心脏管在动脉极继续进行心源性分化形成心房和心室；受精36 h出现心脏循环；受精48 h后房室瓣和动脉瓣膜形成，心脏发育完成[3]（图2）。斑马鱼和哺乳动物在心脏形成的遗传因素上有很高的相似性，其动作电位、心电图和血管结构与人类相似，因此斑马鱼可以进行活体实时监测心律和血压[4]。

2 基于斑马鱼模型的心血管药物研究

2.1 降血脂

血脂异常给心血管疾病带来了极大的风险，导致多种疾病的产生。基于斑马鱼模型研究，以降低胆固醇和甘油三酯为指标对于研究开发有效的降血脂药物具有重要意义。

韩冰[5]和陈彪[6]采用斑马鱼高血脂模型，分别研究发现黄连中小檗胺和黄连碱通过调节胆固醇代謝具有良好的降血脂作用，对黄连的进一步研究开发提供了参考价值。LI等[7]采用UPLC-MS和HPLC分析，发现人参皂苷Rb1在发酵过程中的潜在途径为Rb1→Rd→F2→CK和Rb1→Rd→Rg3，可显著降低血浆总胆固醇和甘油三酯水平，证明野生冬虫夏草具有制备降血脂人参皂苷的潜力。咖啡多酚可通过降低斑马鱼肝脏胆固醇和脂蛋白的合成，上调胆汁酸的合成，抑制斑马鱼血浆、肝脏和血管系统中胆固醇的积累，有助于防治人类高胆固醇血症[8]。刺芹侧耳菌丝体固体发酵多糖能显著抑制高脂饲料诱导的斑马鱼幼鱼和成年斑马鱼肝脏与肠道组织中的脂质积累，达到降血脂的目的[9]。以上研究表明，基于高血脂斑马鱼模型探究药物降血脂的机制，筛选出降血脂的主要成分，为进一步研究降血脂药物提供了参考价值。

2.2 抗动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是引起冠心病、脑梗死、外周血管病等多种严重心血管疾病的主要原因，可导致动脉供血的组织或器官缺血或坏死。动脉粥样硬化发病机制复杂，是多种因素共同作用的结果。斑马鱼抗动脉粥样硬化模型由高胆固醇饮食和脂多糖诱导，表现出一些与人类动脉粥样硬化相似的早期症状（胆固醇积累、血管炎症、脂质代谢紊乱和氧化应激等），而且还在血管内形成斑块[10]。因此，可以利用斑马鱼建立一种可靠、低成本、高通量筛选抗动脉粥样硬化药物的动物模型。

LIU等[11]采用斑马鱼模型，研究发现天麻中天麻素、豆甾醇、对羟基苄醇、柠檬酸等10种化合物能够刺激血管生成，有利于缺血性心血管疾病和动脉粥样硬化的治疗。YANG等[12]以化学诱导的斑马鱼幼虫的血管功能不全和心肌梗死为模型，对三七花中提取的皂苷进行内皮细胞迁移实验，结果表明，三七花可以促进血管生成，改善急性心肌梗死。由红曲精制成的血脂康，在斑马鱼高脂血管内皮细胞和中性粒细胞模型中，可通过降低血脂和抑制中性粒细胞在血管中的募集来预防动脉粥样硬化[13]。迷迭香酸可能通过降血脂、抗氧化、抗炎和改善低剪切力诱导血管内皮细胞功能紊乱，具有很好的抗动脉粥样硬化的作用[14]。吲哚-3-甲醇可能通过增强抗氧化作用和PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬，使高胆固醇饮食斑马鱼的血管壁脂质沉积水平显著降低，为以吲哚-3-甲醇开发一种防治动脉粥样硬化的药物研究提供了参考价值[15]。

2.3 保护心脏

斑马鱼作为低等的脊椎动物，在心脏发育、心脏结构和生理方面与其他脊椎动物相似[16]。斑马鱼发育早期阶段，其胚胎透明，心脏和血液循环清晰可见，斑马鱼的心脏功能和形态均可以通过显微镜进行定量分析[17]。因此，斑马鱼模型可以更好地用于生物体的心脏研究，有利于药物筛选。

黄芪中黄芪甲苷IV对乌头碱所致的斑马鱼心律失常有拮抗作用，能改善斑马鱼心脏结构损伤，具有心脏保护作用[18]。西洋参70%乙醇提取物能改善特非那定所致斑马鱼心脏损伤的心率和SV-BA间距，对修复心脏损伤具有一定的作用[19]。在特非那定诱导的斑马鱼心肌病模型中[20]，通过使用脑心通治疗后可以显著恢复由心功能不全引起的心血管畸形，表明脑心通可以通过HEG1-CCM信号恢复斑马鱼的心肌损伤和心功能不全，其中芍药苷和丹酚酸B被认为是具有心肌保护作用的主要生物活性成分。白藜芦醇对酒精引起的斑马鱼胚胎形态和功能异常（包括体长缩短、心包水肿和心动过速等）具有保护作用，还会改变一些心脏相关基因的表达，例如bmpr2b、hand2和tbx5a等[21]。此外，白藜芦醇还可以通过抑制氧化应激来防止PM2.5诱导的心脏畸形，抵消PM2.5中的可提取有机物诱导的斑马鱼胚胎心脏中ROS产生、DNA损伤和细胞凋亡[22]。斑马鱼模型有利于心脏损伤机制的研究，为进一步开发心脏保护药物提供了方向。

2.4 抗血栓

血栓是一种较常见的心血管系统疾病严重威胁人类的生命健康，往往是外界因素和环境因素相互作用的结果。斑马鱼的血小板与人类的血小板高度类似[23]，由于斑马鱼胚胎透明可在显微镜下动态观察斑马鱼体内动脉或静脉血栓的形成，实验干扰小，斑马鱼的血栓模型稳定，重现性好，常被应用于抗血栓药物的研究。

研究表明，三棱80%乙醇提取物中乙酸乙酯提取部分的主要化学成分包括对羟基苯甲酸、5-羟甲基糠醛、对甲氧基苯甲醛、对羟基苯甲醛、对香豆酸、阿魏酸、香草酸、原儿茶酸、香兰素、Methyl-3，6-dihydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）-ethynyl]benzoate及1，3-O-二阿魏酰基甘油，对斑马鱼血栓模型具有显著的抗血栓作用[24]。利用斑马鱼血栓模型研究发现，通脉增加了血栓斑马鱼心脏血流量，减少外周红细胞聚集并恢复外周血小板循环，降低血栓鱼体内的氧化应激和脂质过氧化水平，降低凝血因子II（凝血酶）和下游纤维蛋白原的表达，从而达到内源性抗血栓作用，其中隐丹参酮为抗血栓的主要活性成分[25]。以盐酸肾上腺素诱导建立斑马鱼血栓模型，筛选出9味具有显著预防和治疗血栓的中药，包括川芎、郁金、延胡索、丹参、红花、虎杖、三棱、莪术、水蛭，为活血化瘀中药的筛选提供了参考依据[26]。通过比较白芍不同部位、主要成分及主要代谢产物，研究表明，芍药苷代谢素-I具有显著的促血管生成和抗血栓的作用[27]。另外，经研究证实，丹参-红花[28]和葛根[29]等均具有较好的抗血栓作用，为进一步抗血栓药物的研究提供了研究方向和参考价值。

2.5 抗炎

炎症的研究在分子和细胞水平上难以完成，主要依赖于体外试验研究。斑马鱼胚胎在发育早期是透明的，受精48 h后可以观察到中性粒细胞，斑马鱼的先天免疫系统在受精后4周才能形成，因此斑马鱼抗炎模型可以作为抗炎药物的筛选。此外，斑马鱼还可以评估水肿形成、渗出液中炎症细胞的积累、介质、信号通路、基因表达和特定蛋白质的产生，在研究炎症反应及其病理、生理学方面具有多功能性[30]。

基于斑马鱼构建炎症模型用以评价西洋参样本的抗炎活性，结果表明人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg4、3-O-甲基没食子酸、齐墩果酸、镰叶芹二醇是西洋参发挥抗炎作用的主要药效物质[31]。连翘苷A和连翘苷B可以导致ROS和NO的减少，以及由CuSO4诱导的各种代谢物、蛋白质和基因产物的改变，从而减少炎症，具有神经保护的特性，对CuSO4诱导的斑马鱼炎症具有显著的抑制作用[32]。采用LPS诱导的斑马鱼炎症模型，发现虫草素可以显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等促炎细胞因子的表达和尾鳍损伤模型中的中性粒细胞迁移，结果表明虫草素在抑制LPS和损伤性炎症中具有重要作用[33]。LI等[34]采用DSS诱导的斑马鱼炎症性肠病模型来研究菊花茎叶提取物的抗炎和抗氧化作用，结果表明菊花茎叶提取物中的类黄酮、酚酸和多糖可通过调节IL-1β、IL-8和MMP9的表达来改善斑马鱼炎症性肠病。

2.6 其他

基于斑马鱼的优势和特点，可以利用斑马鱼建立糖尿病或高血糖模型有利于研究糖尿病微血管并发症[35]。肉苁蓉提取物对斑马鱼的中枢神经系统具有保护作用[36]。丹参酮-IIA的咪唑生物碱类似物可能通过诱导ROS的产生和激活DNA损伤有效阻断体内乳腺癌的侵袭和转移[37]。

3 小结与展望

斑马鱼作为研究开发心血管疾病治疗药物的生物模型，其基因与人类基因的相似程度较高，体外受精繁殖能力強、饲养成本低、胚胎透明易于观察、实验结果重现性好、实验预测性好。这些特点能够更好地补充完善一些哺乳动物试验模型的不足，弥补体外试验与哺乳动物试验之间所产生的巨大生物学差异，从而使实验操作便捷、高效、可信度高。但是，某些药物的作用机制不明确、斑马鱼相对较小的血管直径与人体血管之间的关系尚不清楚、研究中药物剂量与人类临床使用剂量的换算存在差异、疾病发展的复杂性以及斑马鱼在生长发育过程中存在被忽略的潜在病理性过程等一系列问题仍需进一步地研究和探讨。总的来说，随着科学研究的深入，斑马鱼被用作研究心血管疾病发病机制、分析心血管疾病的病理过程和筛选疾病治疗药物等方面的生物模型具有广阔的前景，再结合斑马鱼的体内试验与体外实验结果，将为治疗心血管疾病药物的研发取得进一步的突破提供基础。

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