基于网络药理学探讨千金黄连丸对疾病动脉粥样硬化的分子机制

包鹃　李雯丽　曾梅兰　陈文雅　梁佳华　伍兴汝　韦炜

摘 要：目的 基于网络药理学探讨千金黄连丸（qianjin huanglian wan，QHW）对疾病动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的分子机制。方法 通过检索Batman—TCM、Uniprot、GeneCards、DisGeNET等多个数据库，对QHW的活性成分和对应的靶点以及AS的相关疾病基因进行分析，筛选关键靶点，并在Venny2.1软件下建立QHW-活性成分-靶点-通路网络图，利用STRING数据库构建所获得的相关靶点之间作用网络效应图。结果 通过String数据库的富集分析功能，得到QHW治疗AS的活性成分12个，靶点94个。通过Network Analyzer拓扑分析得到28个关键靶点，MCODE聚类分析得到6个核心基因。GO富集分析得到1 257条生物过程，74项分子功能相关，44项细胞组成。KEGG功能富集分析得到47条信号通路。结论 初步了解QHW干预AS的多成分、多靶点、多通路作用机制，为进一步研究AS提供更精确的理论依据。

关键词：生地；黄连；动脉粥样硬化；网络药理学；分子机制

中图分类号：R966

文献标志码：A

Exploring the molecular mechanism of Qianjin Huanglian Pill for the treatment of atherosclerosis based on network pharmacology

BAO Juan LI Wenli ZENG Meilan CHEN Wenya LIANG Jiahua WU Xingru， WEI Wei

（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guangxi University of Traitional Chinese Medicine， Nanning 530200， China; 2. Department of Cardiology， Nanning Second Peoples Hospital， Nanning 530200， China）

Abstract： Objective To explore the molecular mechanism of Qianjin Huanglian Pill （QHW） on disease atherosclerosis （AS） based on network pharmacology. Methods The active ingredients and corresponding targets of Huanglian and Shengdi and the related disease genes of AS were analyzed by searching several databases such as Batman-TCM， Uniprot， GeneCards， DisGeNET， etc.， to screen the key targets. The network diagrams of the active ingredients， targets and pathways were established under Venny2.1 software， and the network effect diagrams between the obtained relevant targets were constructed using STRING database. Through the enrichment analysis function of STRING database， 12 active ingredients and 94 targets of QHW were obtained for the treatment of AS. The enrichment analysis of GO yielded 1 257 biological processes， 74 molecular function-related and 44 cellular compositions. 47 signaling pathways were obtained by enrichment analysis of KEGG function. Conclusion This study preliminarily understands of the mechanism of action of multiple components， multiple targets， and multiple pathways of Qianjin Huanglian Pill for the treatment of atherosclerosis， and provides a more accurate theoretical basis for further basic research.

Key words： Shengdi; Huanglian; atherosclerosis; network pharmacology; molecular mechanism

動脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种常见的以动脉管壁增厚、变硬和弹性减低为主要特征的循环系统疾病，是冠心病、颈动脉疾病及周围动脉疾病的共同潜在病因[1]。AS的确切病因和发病机制尚未完全明确，但AS与高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟、遗传等危险因素密切相关。大量研究表明，脂质在脉管上沉积、血管内皮受损及炎症反应的发生是AS形成的关键病理环节。中医虽无“AS”，但其病因病机及证候与中医的“痰浊”“瘀血”“胸痹”等病症相对应。中医认为，“痰”“瘀”是由于脾虚和肾虚，导致津液、水谷精微代谢异常形成的[2]，痰浊瘀血经久不散，凝结于脉管之上，则表现为血管腔狭窄及血液动力学障碍，血管稳态和结构遭到破坏，以致痰瘀互结，即AS斑块形成[3]。

千金黄连丸（qianjin huanglian wan，QHW）是古代中医首次记载于《千金要方》的方剂。它由黄连、地黄2种中药组成。黄连是毛茛科黄连的一种草本植物。本品性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。地黄是一种高山植物，性味甘、寒、苦，它既能滋阴生津，又能清热凉血。药理学研究发现黄连影响心血管系统的主要成分是小檗碱[4]。小檗碱保护内皮细胞（endothelial cells，ECs）免受细胞炎症因子的破坏，使血管形态功能不受影响，同时减少血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖，另外小檗碱具有降低巨噬细胞系统活性的功能[5]。地黄发挥血管保护作用的有效成分主要有環烯醚萜苷类化合物和苯乙醇苷类，可以减少巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞[6-7] 。地黄的苷类和萜类配伍黄连的小檗碱能够调节血中脂类成分，对血管内皮功能有调节作用。综上所述，地黄可通过减少泡沫细胞的形成来抑制AS的进展。本研究将运用网络药理学数据挖掘和分析方法，探索活性成分－靶点－疾病与黄连、地黄配伍治疗AS的关系，挖掘黄连、地黄配伍治疗AS的有效成分和分子机制。

1 材料与方法

1.1 QHW的成分靶点信息查询

在Batman-TCM数据库中进行筛选，以补充黄连和地黄的化合物及相关靶标，并将QHW组分靶标得分大于20的纳入筛选。将所有目标输入Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），筛选出人体靶标并删除非人体靶标。合并在TCMSP数据库收录的成分和靶点，进行汇总和删重。

1.2 AS靶点查找

将“atherosclerosis”作为关键词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）以及NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索人类基因。综合检索结果，通过去重等进行对比分析，其中，GeneCards数据库所获得的靶点依据得分进行参数平均度值（degree）筛选以获得更密切相关的靶点。

1.3 蛋白质相互作用（protein protein interaction，PPI）网络构建、拓扑分析及MCODE聚类分析

在STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）数据库中输入QHW和AS的交集靶点，并设定生物种类为“Homo sapiens”，得到相关的PPI网络关联图后导入Cystoscape 3.8.0工具中进行拓扑分析：在NetworkAnalyzer工具中，进行Degree排序后，选择分值超过平均分的基因作为关键靶点。通过MCODE分析，可以实现对核心基因的检测和筛选。构建好的PPI网络导入到Cytoscape 3.8.0中，利用MCODE模块进行基因簇的分析和核心靶点的筛选，这一步可以完成相关核心靶点的分析。

1.4 成分-疾病-靶点网络构建

为了更好地理清成分、疾病以及相应靶点之间错综复杂的关系，基于纳入的地黄和黄连的成分、治疗的疾病以及药物作用于疾病的相关靶点，QHW利用Cytoscape 3.8.0软件构建出成分-疾病-靶点网络图构建出来。

1.5 关键成分筛选

利用Cytoscape 3.8.0对上一步构建的网络图进行拓扑分析，完成QHW关键成分的筛选。将成分按照数值的高低进行Degree排序，Degree值越高，代表成分越重要。可以选取大于平均度值的成分作为关键成分进行后续的研究。

1.6 GO富集分析与KEGG通路富集

将药物与疾病共有的靶点进行GO富集分析，在STRING数据库中筛选出P校正<0.05的项目。针对药物和疾病的共同靶点进行KEGG的通路富集分析，利用STRING数据库筛选出P校正<0.05的项目。然后利用R 4.0.3 软件，引用ClusterProfiler、Enrichplot和ggplot2包（KEGG通路富集仅引用ClusterProfiler），绘制出相对应的柱状图和气泡图。

1.7 中药成分-疾病-通路-靶点网络构建

运用Cytoscape 3.8.0工具，将所获得的成分-疾病-通路-靶点网络文件导入其中，绘制出通路网络关联图。每条边表示节点与节点之间的靶向关系，可以简洁地呈现出QHW的活性成分在对疾病AS的疗效中相关成分和核心靶点的效应特点。

2 结果

2.1 QHW的成分靶点信息查询

通过Batman-TCM数据库、Uniprot数据库的补充和校正，合并在TCMSP数据库收录的经过汇总和删重，黄连获得9个化合物成分和156个靶点；生地获得4个化合物成分和216个靶点。

2.2 动脉粥样硬化的靶点查找

经检索，DisGeNET数据库筛选得到相关靶点共2 044个；NCBI数据库筛选得到相关靶点共1 138个；GeneCards数据库筛选得到相关靶点共1 145个。经3个数据库的基因合并和去重后，得出与AS相关的基因共2 723个。使用韦恩图制作软件Venny 2.1取AS与QHW的共有靶点交集，筛选出药物和疾病的交集靶点94个，这些共有靶点即药物作用于疾病的预测靶点，对其进行以下通路富集分析，得到韦恩图（图1）。

2.3 PPI网络的构建和拓扑分析

此PPI网络中共有节点94个，边292条，所得的平均度值为6.21。图2为运用STRING网站导出的PPI网络关联图的结果导入Cytoscape软件绘制的PPI网络图（此图中的节点大小与颜色根据度值会有相应的变化，随着节点的增大及颜色的加深，其所获得的度值也相应增大；图中线由细到粗即表示Edge betweenness由小到大）。根据拓扑分析筛选药物-疾病的关键靶点，总共得到关键靶点28个，使用R 4.0.3对这28个靶点进行柱状图的绘制，如图3所示（图中的横坐标代表靶点的度值）。

2.4 MCODE聚类分析

在MCODE聚类分析中，共得到6个核心基因和6个基因簇。其中核心基因NR1I2、EGFR、F11、ESR1、SCN7A、MT-CO2，具体结果见表1。

2.5 成分-疾病-通路-靶点网络构建

由94个节点，12个活性成分与疾病AS及2个药物成分相互连接，彼此交织成网形成了成分-疾病-通路-靶点网络，见图4。

2.6 关键成分筛选

取degree分值排序前10的成分，从高到低分别为γ-氨基丁酸、三羟基丁磷酸胆酸、菜油甾醇、雷姆凝集素C、非洲防己碱、掌叶防己碱木兰花碱、黄麻苷A、茄镰饱菌素、广玉蘭内酯，这10种活性成分可能在黄连-地黄配伍干预AS的过程中起关键作用。见表2。

2.7 GO富集的分析与KEGG通路的富集

GO富集分析后得到的生物过程共1 257条，分子功能相关共74项，细胞组成相关共44项，利用相关软件绘制出相关的柱状图（图5）。KEGG通路富集后得到相关信号通路共47条，使用相关软件进行气泡图的绘制，具体信息见图6。由图6可见，QHW可通过多个信号通路协同治疗AS，各通路间存在上下游关系，各靶点间存在相互作用关系。

2.8 中药成分-疾病-通路-靶点网络构建

取KEGG富集分析的20条最显著的相关信号通路与2.5得到的成分-疾病-通路-靶点网络进行汇总，得到中药成分-疾病-通路-靶点网络图，见图7。由图7可见，QHW可通过多个信号通路协同干预AS，各通路间存在上下游关系，各靶点间存在相互作用关系。

3 讨论

AS斑块的形成是疾病发生发展的主要过程，斑块的形成与内皮细胞的改变与脂质的沉积有关。而内皮损伤也会引起机体产生反应，比如炎症、免疫应答等。QHW中黄连和地黄均有保护内皮细胞免受炎症因子破坏的作用以及抑制泡沫细胞生成等功能[8]，证明QHW在治疗AS中有明确的疗效。本研究结合多篇相关文献并利用网络药理学研究方法进行初步分析，从药物活性成分、靶点、基因、作用通路等微观角度多方面说明QHW对AS的作用机制。通过拓扑学分析结果可见，γ-氨基丁酸（gamma-aminobutync acid，GABA）、三羟基丁磷酸胆酸、菜油甾醇等12种活性成分可能为QHW作用于AS的关键活性成分。外周的GABA可以作用于GABAA受体和GABAB受体，这2个受体分别具有扩张血管和抑制交感神经的作用。GABA与这两个受体结合后，通过扩张血管、降低血压，可发挥减少血管内皮损伤的作用[9]。表达于外周树突状细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等细胞膜上的GABAA受体激活后可以通过抑制炎症免疫细胞的活性，减轻炎症反应，改善巨噬细胞内异常的胆固醇转运，抑制巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α），从而延缓动脉粥样硬化[10-11] 。GABAA受体激动剂通过下调单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的mRNA和 P-pMAPK38的蛋白表达来抑制AS斑块形成，以抑制AS斑块形成蛋白（ABCA1、SR-BI等） 的表达，下调胆固醇逆转运蛋白SR-A、LOX-1的表达，从而抑制泡沫细胞形成[12]。

摄入适量的胆固醇有重要的生理意义，但摄入过多则会引起AS。菜油甾醇是植物甾醇之一。植物甾醇能以浓度依赖性方式减少胆固醇的吸收，不仅能降低血清中胆固醇的浓度，还能有效缓解高脂血症和延缓AS[13-14]。

植物甾醇与胆固醇有相似的化学结构，二者不同之处仅在于侧链，因此，植物甾醇降血脂的机制很可能与竞争结合胆固醇受体有关，植物甾醇可以通过阻止胆固醇的酯化作用和胶体颗粒的形成，有效地减少胆固醇的吸收[15-16]。

在 PPI 网络中，拓扑分析显示有5个靶点处于拓扑网络结构中心，包括ESR1、FOS、GPT、EGFR、INS，它们可能是治疗AS的关键靶点。MCODE聚类分析结果显示核心基因为NR1I2、EGFR、F11、ESR1、SCN7A、MT-CO2，表明6个核心基因可能在QHW治疗AS过程中发挥较重要的作用。其中关键靶点之一EGFR是一种受体型的蛋白酪氨酸激酶，可以参与血管中内皮细胞的增殖、迁移及分化的过程[17]。C-反应蛋白则可诱发血管内皮分泌促炎因子[18]，促进巨噬细胞摄取低密度脂蛋白[19]，增加血管内皮泡沫细胞含量，并加速合成纤溶酶原激活物抑制剂因子和促凝血因子，促进血栓形成[20]。目前，大量的研究表明，AS发生和发展的每一个环节都涉及炎性反应[21]。

GO富集分析显示，QHW可以通过负调节对外界刺激的反应、肽激素生成的反应、血液循环、羧酸生物合成等生物学过程，发挥一定的调节作用来干预AS；这些靶点主要位于囊泡腔、呼吸链复合体、胞质囊泡腔、细胞色系复合体、肌纤维膜等处，具有核受体活性，配体激活等分子功能。KEGG途径富集结果显示，QHW干预AS的主要通路有精氨酸生物合成、补体和凝血级联系统、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢、钙信号通路等。精氨酸生物合成通路中精氨酸作为血管功能调节因子可以改善内皮功能，从而改善心血管结局。其中精氨酸酶和一氧化氮合酶介导的精氨酸在免疫细胞中的代谢对AS反应过程起重要的抑制作用[22]。补体与凝血级联系统中血小板微粒有助于单核细胞黏附在发生炎症反应的内皮上，加速泡沫细胞的形成，从而加速AS的形成和发展[23]。脂肪因子直接影响内皮功能、血小板和单核细胞，并产生补体因子维持炎症，使AS加重[22，24]。QHW中黄连和生地黄均有保护内皮细胞免受炎症因子破坏的作用和抑制泡沫细胞生成等功能。因此，QHW可以通过保护内皮细胞和抑制炎症反应来延缓动脉粥样硬化。

综上，应用网络药理学方法探析了QHW通过主要活性成分调控关键靶点起到干预AS的作用，是在现有的数据库基础上进行深究，彰显了QHW活性成分在治疗AS过程中的相关成分和核心靶点之间的作用特点，为今后中药药效及作用机制的研究提供指导。

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