柴胡煎剂缓解小鼠疟疾症状研究

乔继琛　肖扬婧卿　刘超明　邹标　崔令花

摘 要：目的 探讨柴胡煎剂是否对疟疾小鼠有缓解症状的治疗作用。方法 采用约氏疟原虫17XNL虫株感染6～8周龄小鼠，制备疟疾小鼠模型。每天尾静脉采血计算小鼠红细胞疟原虫感染率。待疟疾小鼠模型红细胞感染率达到3%左右，随机将疟疾小鼠分成治疗组和对照组。治疗组使用柴胡煎剂灌胃治疗，根据柴胡煎剂的用量不同分为低剂量组（0.5 mL，含生药0.05 g）和高剂量组（0.5 mL，含生药0.10 g）；对照组使用相同体积生理盐水灌胃。每天观察并记录治疗组和对照组疟疾小鼠模型红细胞疟原虫感染率的变化；随机测量所有小鼠体温变化情况。记录小鼠的生存时间，灌胃7 d后小鼠摘眼球取血对比血红蛋白含量等常见血常规指标并手术取小鼠肝脏、脾脏称重，比较3组小鼠肝重比、脾重比。结果 治疗组和对照组小鼠红细胞疟原虫感染率并无明显差异（P＞0.05）；对照组小鼠体温高于治疗组；治疗组小鼠生存率明显高于对照组（P＜0.05）；低剂量组与高剂量组在血红蛋白含量上无差异，在白细胞计数、红细胞计数、血细胞压积、血小板计数上无差异，3组小鼠脾重比无差异（均P＞0.05），高剂量组小鼠肝重比明显大于低剂量组（P＜0.05）。结论 在特定剂量下柴胡煎剂对约氏疟原虫并无直接杀伤作用；但在减少小鼠发热、减轻小鼠肝肿大，提升小鼠存活率方面有一定作用。

關键词：柴胡煎剂；约氏疟原虫；感染率；治疗作用

中图分类号：R381；R282

文献标志码：A

Relieving malaria symptoms in mice with bupleurum decoction

QIAO Jichen XIAO YangJingqingLIU Chaoming ZOU Biao CUI Linghua

（1. Department of Basic Medical Science， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China; 2. Department of Clinical Laboratory， Fuzhou First Peoples Hospital， Fuzhou 344000， China）

Abstract： Objective To investigate whether bupleurum decoction has therapeutic effect alleviateing the symptoms of malaria on malaria mice. Methods Malaria mouse model was prepared by infecting 6-8 weeks old mice with 17XNL strain of Plasmodium yoelii. The infection rate of plasmodium in mouse red blood cells was counted by daily tail vein sampling. When the red blood cell infection rate of malaria mouse model reached about 3%， malaria mice were randomly divided into 2 treatment groups and a control group. The treatment groups were given bupleurum decoction by gavage and divided into a low dose group （0.5 mL， containing crude drug 0.05 g） and a high dose group （0.5 mL， containing crude drug 0.1 g）. The control group was given 0.5 mL normal saline by intragastric administration. The change of plasmodium infection rate in erythrocyte of malaria mouse model in the treatment groups and the control group was observed and recorded every day. The temperature changes of all mice were measured randomly. The survival time of the mice was recorded. After 7 days of intragastriction， blood was taken from the eyeballs of the mice to compare the changes of common blood routine indexes such as hemoglobin content. The liver and spleen of the mice were surgically taken and weighed to compare the liver weight ratio and spleen weight ratio of the 3 groups. Results There was no significant difference in plasmodium infection rate among the treatment groups and control group （P>0.05）. The body temperature of the control group was higher than that of the treatment group. The survival rate of mice in the treatment groups was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. There was no difference in hemoglobin content， white blood cell count， red blood cell count， hematocrit， and platelet count between the low dose group and the high dose group. There was no difference in spleen weight ratio among the 3 groups （all P>0.05）. The liver weight ratio of the high dose group was significantly higher than that of the low dose group （P<0.05）. Conclusion Bupleurum decoction has no direct killing effect on plasmodium. yoelii at specific dose. However， it has a certain effect on reducing fever， alleviating liver enlargement， and improving survival rate of mice.

Key words： bupleuri decoction; Plasmodium yoelii; infection rate; therapeutic effect

疟疾是一种由疟原虫感染经按蚊传播的传染病[1]。疟疾曾在全球多个地区广泛流行，病死率较高[2]。据WHO统计，2020年全世界约有2.41亿疟疾感染病例和62.7万疟疾死亡病例[3]。屠呦呦教授提纯的青蒿素类药物明显降低了疟疾患者的病死率[4]，青蒿素一度被称为抗疟神药。但近年来有研究表明，在东南亚地区发现疟原虫已经出现了对青蒿素的耐药性，并有逐步向全球蔓延的趋势[5]。柴胡是中医诊疗中常用的药物，中国药典中收录的柴胡有柴胡和狭叶柴胡2种，分别被称为“北柴胡”和“南柴胡”[6]。中医典籍记载，柴胡具有疏肝解郁、解退热以及抗疟疾寒热发作等作用[7]。现代药理研究显示，柴胡具有抗炎、镇痛、镇咳、抗病原体等多种作用[8]；2种柴胡药理作用类似，在多种情况下可相互代替使用。虽然中医典籍对柴胡抗疟作用多有记载，但其临床研究报道并不多见，1960年有临床医生报道了使用柴胡煎剂治疗44例疟疾患者，取得了良好的效果[9]。而在柴胡抗疟原虫感染方面的动物实验，尚未见到相关研究报道。随着疟原虫对青蒿素耐药趋势的出现，全球疟疾防控压力面临严峻考验[10-13]。在后青蒿素时代，急需筛选备用药物来应对疟原虫耐药虫株的产生。通过广泛阅读相关文献，筛选出中药柴胡可能具有治疗疟疾的作用。本研究拟采用中药北柴胡饮片煎剂对疟疾小鼠模型进行灌胃治疗，观察柴胡煎剂对疟疾小鼠红细胞疟原虫感染率的影响，以验证柴胡对疟疾的治疗作用，为抗疟药物研发奠定基础，为传统中医药开发及创新使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

昆明小鼠20只，6～8周龄，雌性；体重为（20±2） g。由江西中医药高等专科学校动物实训中心动物房提供。

1.1.2 儀器与试剂

电子天平（JCS-K）购自凯丰集团有限公司；红外体温测量计（CK-T1501）购自深圳市长坤科技有限公司；全自动血液分析（XS-900i）购自希森美康医用电子有限公司，试剂为厂家配套试剂。移液器、灌胃针、烧杯、生理盐水等物品由学校实训中心统一招标采购。

1.1.3 中药饮片

北柴胡购自江西洪兴大药房， 产地为甘肃省；中药饮片经煎煮浓缩后制成水煎剂，每1.0 mL含药 0.20 g。

1.2 方法

1.2.1 制备疟疾小鼠模型

从超低温冰箱取出保存的约氏疟原虫17XNL虫株，进行疟原虫复苏，后续进行传代培养。使用1×106个约氏疟原虫17XNL虫株腹腔注射感染小鼠，制备疟疾小鼠模型。

1.2.2 制备柴胡煎剂

北柴胡煎剂按照中药传统煎剂配制方法且参考药理学相关文献研究经验：使用10.00 g柴胡加入100.0 mL纯净水，煎药方法先武火水沸腾后改用文火，煎药时间约为2 h，最终水煎液为50.0 mL。即最终制备柴胡水煎液为10.00 g/50.0 mL生药（0.20 g生药/mL）；最终灌胃浓度使用纯净水调配。

1.2.3 随机分组灌胃治疗

每天对疟疾小鼠模型进行尾静脉采血、制作血涂片染色并通过显微镜油镜镜检，观察小鼠疟原虫的感染情况，并计数小鼠红细胞疟原虫感染率。待疟疾小鼠模型红细胞感染率达到3%左右，采用随机分组方式将疟疾小鼠分成治疗组和对照组。治疗组根据对中药饮片柴胡煎剂的用量不同再次分为低剂量组和高剂量组。根据相关文献，低剂量组使用0.5 mL含0.05 g生药；高剂量组使用0.5 mL含0.10 g生药；连续灌胃治疗7 d。对照组使用相同体积生理盐水进行灌胃治疗。

1.2.4 测量体温，取血及肝脏、脾脏标本

每天固定时间观察实验组和对照组疟疾小鼠模型红细胞疟原虫感染率的变化，并记录原虫率变化情况。同时使用红外线体温仪每天测量记录小鼠体温变化，对比治疗组和对照组小鼠体温差异，验证柴胡对小鼠疟疾退热作用的效果。在灌胃治疗7 d，停药观察2 d后全部小鼠摘眼球取血，取血后制作血涂片将剩余血液做血常规检测。取血后脱颈椎处死小鼠，分别取小鼠肝脏、脾脏称重；计算肝重比与脾重比。

1.3 统计学处理

采用Excel办公软件建立数据库，使用Graphpad 6.0和SPSS 22.0统计学软件分析处理数据并制作图标。计量资料数据以均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；多组数据不同时间对比采用单因素方差分析。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠红细胞疟原虫感染率

对实验组和对照组小鼠分别进行不同剂量的柴胡煎剂和同等体积的生理盐水治疗1周。灌胃治疗当天（1 d）开始至灌胃治疗1周后第2天（8 d）每天同一时间进行尾静脉采血，取血后制作血涂片，吉姆萨染色后镜检；并于第9天（感染疟原虫第13天）摘眼球取血涂片染色后镜检。结果显示，柴胡煎剂低剂量组、高剂量组与对照组在小鼠疟原虫红细胞感染率并无差异（P＞0.05），仅在个别天数有一定差异（图1）。

2.2 小鼠体温

疟疾的典型表现有周期性寒战发热的症状，在整个实验过程中，课题组成员使用红外线电子体温计在采血前测量小鼠的体温，由于设备限制很难实时捕捉小鼠发热的情况。在对照组中，小鼠体温高于37 ℃的次数有5次，分别是37.4 ℃、37.3 ℃、37.6 ℃、37.2 ℃、37.2 ℃；实验组小鼠体温未能检测到高于37 ℃，因多数情况下体温均不高，故37 ℃以下体温未做详细记录。

2.3 小鼠存活率

小鼠建模成功后，低剂量、高剂量组小鼠无死亡；对照组小鼠分别在第7、12、13天各死亡一只（图2）。

2.4 血常规部分指标差异情况

第13天对小鼠摘眼球取血，进行血常规检测分析。因对照组小鼠死亡3只（共6只），且在取血过程中有血液凝固的情况，以致于只有实验组标本可以正常进行血常规检测。其中，低剂量组与高剂量组小鼠在白细胞计数（white blood cell count，WBC）、红细胞计数（red blood cell count，RBC）、血小板计数（platelet count，PLT）、血红蛋白含量（hemog lobin，Hb）、血细胞比容（hematocrit，HCT）等方面差异均无统计学意义（均P＜0.05，表1）。

2.5 肝重比、脾重比差异情况

3组小鼠在脾重比上比较差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组小鼠肝重比为（0.11±0.01），明显大于低剂量组小鼠（0.09±0.01）（P＜0.05）；对照组小鼠与高剂量组小鼠及低剂量组与高剂量组小鼠间肝重比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

柴胡抗疟原虫感染方面的动物实验，尚未见到报道。研究结果显示，柴胡煎剂低剂量组、高剂量组与生理盐水治疗组在小鼠疟原虫红细胞感染率并无差异（P＞0.05），仅在个别天数有一定差异，证实柴胡煎剂在0.05 g/d和0.10 g/d的剂量下并不能够杀死疟原虫。因对照组小鼠陆续有死亡情况，导致小鼠数据偏少可能导致后面原虫率的波动；且本实验使用的约氏疟原虫非致死株，后期会有疟原虫减少甚至消失的情况。

在小鼠体温测量上，由于设备限制很难实时捕捉小鼠发热的情况。使用红外线电子体温计于尾静脉采血前测量小鼠体温，喂药前3 d均未能检测到高于37 ℃体温。初步证实柴胡对治疗疟疾小鼠发热有一定作用，与相关研究相符[14]。在以后实验中，将尝试使用实时体温检测系统进行监测，以保证体温结果更好的连续性及可靠性。

在小鼠建模成功后，低剂量、高剂量组小鼠无死亡；对照组小鼠分别在第7、12、13天死亡各一只。结果表明，柴胡煎剂在减少疟疾小鼠损伤、延长小鼠寿命上有一定积极作用。

高剂量组有一只小鼠在摘眼球取血中因固定手法问题未能摘到小鼠眼球，放回笼子准备再次固定小鼠时，该小鼠很快死亡；系人为固定手法不当导致小鼠死亡，并未列入死亡小鼠数据。在建模后第13天对小鼠摘眼球取血，对照组1只死亡，紧急取血未成功。对照组另外3只小鼠取血后2只血液出现凝固，一只取血量较少，不能进行血常规检测。低剂量和高剂量组未见血液凝固现象；仅高剂量组一只小鼠取血量较少未进行血常规检测。研究证实，低剂量组与高剂量组小鼠在WBC、RBC、PLT、Hb、HCT上差异均无统计学意义。其中，血常规仪器可能会误将感染疟原虫的红细胞判断为白细胞导致WBC增高，后续将尝试分析疟原虫红细胞感染率与仪器测量WBC的关系，以期为更好地诊疗疟疾提供参考。

疟疾患者会有肝脾肿大的表现，本研究计算疟疾小鼠肝重比与脾重比来分析柴胡对疟疾的治疗作用。研究显示，3组小鼠在脾重比上两两比较均无差异；对照组小鼠肝重比明显大于低剂量组小鼠；对照组小鼠与高剂量组小鼠及低剂量组与高剂量组小鼠间肝重比差异无统计学意义。研究初步证实柴胡对缓解小鼠肝肿大有一定作用；但高剂量组小鼠肝肿大情况要高于对照组和低剂量组；这可能和柴胡毒性作用有关[15]，临床应用中应注意合适用量。

综上，在特定剂量下柴胡煎剂对约氏疟原虫并无直接杀伤作用，但在减少小鼠发热、减轻小鼠肝肿大，提升小鼠存活率方面有一定的积极作用。

参考文献：

[1]MILNER D A Jr. Malaria pathogenesis[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine， 2018， 8（1）： a025569.

[2]LOVER A A， BAIRD J K， GOSLING R， et al. Malaria elimination： time to target all species[J]. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene， 2018， 99（1）： 17-23.

[3]World Health Organization. World Malaria Report 2021[R]. Geneva： World Health Organization， 2021.

[4]杨博， 孙毅凡， 雷瑶， 等. 青蒿素及其衍生物治疗疟疾的研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 2021， 39（3）： 393-402.

[5]WOODROW C J， WHITE N J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread[J]. Fems Microbiology Reviews， 2017， 41（1）： 34-48.

[6]陈良胜， 殷双兴. 柴胡应用与指纹图谱研究进展[J]. 中国民族民间医药， 2021， 30（23）： 60-64.

[7]王和平， 黄金勇， 徐美术. 柴胡饮片古今研究概况[J]. 中医药信息， 2005， 22（2）： 15-19.

[8]舒文将， 姚昕利， 陈宗游， 等. 中药柴胡的药理研究与临床应用[J]. 广西科学院学报， 2017， 33（4）： 268-273.

[9]李凤春. 柴胡治疗疟疾44例的疗效观察[J]. 中华内科杂志， 1960， 8（6）： 560.

[10]O'FLAHERTY K， ATADE R， ZALOUMIS S G， et al. Contribution of functional antimalarial immunity to measures of parasite clearance in therapeutic efficacy studies of artemisinin derivatives[J]. The Journal of Infectious Diseases， 2019， 220（7）： 1178-1187.

[11]段梦茜， 周隆参， 杨照青. 恶性疟原虫青蒿素抗疟药抗性研究进展[J]. 中国热带医学， 2022， 22（11）： 1086-1091.

[12]ROUT S， MAHAPATRA R K. Plasmodium falciparum： multidrug resistance[J]. Chemical Biology & Drug Design， 2019， 93（5）： 737-759.

[13]田斌， 申晓君， 廖瑜， 等. 长沙市122例输入性恶性疟原虫pfpm2基因拷贝数变异的分析[J]. 第三军医大学学报， 2020， 42（20）： 2012-2017.

[14]兰宝恒， 吴泽青. 柴胡的化学成分及药理作用研究进展[J]. 新乡医学院学报， 2023， 40（2）： 174-180.

[15]張韵， 朱桂芬， 钟苑茗. 柴胡的药理毒理作用及常用量浅析[J]. 内蒙古中医药， 2022， 41（11）： 141-142.