薄层色谱技术在中兽药鉴别检验中的问题

杨 洁，付国平，崔荣飞，吕 洁，刘 伟，陈佳静，朱子晨，赵义良*

(1.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心 050040；2.石家庄市农业综合行政执法支队 050000；3.石家庄市动物疫病预防控制中心 050000；4.石家庄市藁城区畜牧工作总站 052160）

中兽药的质量直接关系到养殖动物的用药安全，从而关系到食品安全。中兽药的鉴别主要采用显微鉴别、光谱色谱和理化鉴别等。薄层色谱，或称薄层层析（thin-layer chromatography，TLC），是色谱技术的一种，是将适宜的固定相涂布于支持板上，形成均匀薄层，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。通过对薄层色谱上是否存在斑点，能够对中兽药的真伪进行准确的判断，斑点的颜色深浅程度以及大小等都能在一定程度上对药品的优劣作出判断。与高效液相色谱法和气相色谱法比较，薄层色谱操作简单，成本较低，色谱结果直观。与纸层析法比较，薄层色谱灵敏度高，分离效果好，用时短，显色方法多，可用腐蚀性显色剂[1]。

薄层色谱技术从上世纪50 年代发展至今，仍被广泛采用，是分析鉴别中兽药的重要方法。《中华人民共和国兽药典》（2020 年版二部）中薄层色谱技术鉴别占鉴别方法80%以上[2-3]。

1 薄层色谱基本原理

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

薄层色谱技术在中兽药检测中的应用主要是鉴别、杂质检查或含量测定，使用时将固定相均匀涂于玻璃板、塑料或铝箔上，待成膜后，用点样器吸取适当样品，点在薄层的起始线上，待干燥后，用适当的展开剂展开，待展开至一定距离后取出，晾干，喷显色剂显色。用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf 值(溶质移动的距离/溶液移动的距离)对各斑点的组分进行鉴定。

2 薄层色谱检测鉴别方法

双黄连口服液是 《中华人民共和国兽药典》（2020年版二部）修订的兽药品种，具有辛凉解表、清热解毒的功能，主治犬、猫、鸡感冒发热。双黄连口服液的鉴别（1）、（2）试验均使用薄层色谱法。

鉴别（1）：取双黄连口服液1 mL，加75%乙醇5 mL，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芪苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液；取绿原酸对照品，加75%乙醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取一聚酰胺薄膜，平铺于洁净玻璃板上，划定起始线，用点样器吸取上述3 种溶液各1～2 μL，点于起始点不同位置，晾干。取适量醋酸于展缸中，放入晾干的展板，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与黄芪苷对照品色谱相应的位置，显相同颜色的斑点；在与绿原酸对照品色谱相应的位置，显相同颜色的荧光斑点。

鉴别（2）：取双黄连口服液1 mL，加甲醇5 mL，摇匀，静置，取上清液，作为供试品溶液。另取连翘对照药材0.5 g，加水20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至近干，加甲醇5 mL 使溶解，摇匀，静置，取上清液，作为对照药材溶液。用取样器吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点[4]。

3 检测方法和注意要点

利用薄层色谱技术对中兽药进行鉴别时，容易精密度差以及重现性不足的情况，在一定程度上降低了检验结果的准确性。

3.1 样品处理

中兽药样品成分复杂，各成分之间干扰严重，有时难以很好的分离，样品的前处理对中兽药薄层色谱检测很重要。韩易航等对清解合剂薄层色谱鉴别试验的前处理进行了改进，用毒性较小的乙醇代替毒性较大的甲醇和丙酮对样品进行前处理，分离效果好，斑点清晰、操作简单，试验结果重复性好，所用试剂更安全，对环境友好[5]。

3.2 薄层板

薄层板需要有一定的机械强度及化学惰性，且厚度均匀、表面平整。玻璃板最常用，有时还用塑料、铝箔。常用的固定相有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F 等。固定相均匀涂布在玻璃板上，晾干后待用。为了良好的重现性，实验室一般直接采购成品薄层板。不同厂家，不同批次的薄层板，质量可能不同。应在采购一批新板子后，进行质量验收，合格后方可使用，并在实验记录中标明板子生产厂家，型号等信息。

薄层板可以自制也可使用成品，实验室一般直接采购成品薄层板。不同厂家生产的薄层板，所用的硅胶粒度、性质、粘合剂和制作工艺都不同，造成色谱行为的差异。实验时必须详细记录薄层板的类型、厂家、批号、实验温度、湿度等信息，保证实验结果的重现性。

3.3 点样

手动点样的点样器最常用的是内径为0.5 mm 管口平整的点样毛细管，有0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL 等。

点样直径应不超过5 mm，尽量减少溶剂扩散，直径应尽量小。点样距离一般为1～1.5 cm 即可。点样量较大时应特别注意点样直径和间距。点样毛细管不能交叉使用。如需重复点样，待溶剂挥发后才可继续点样。可以先用铅笔在薄层板上距一端2 cm 处轻轻划线，作为起始线。在同一块板子上点的样品之间要有一定的距离，通常间距5 mm 以上。点样要轻，不能破坏薄层板上的固定相。

也可使用全自动点样仪，可进行接触式点状点样，喷雾式带状、方形点样；适用于不同厚度的薄层板，最大至4 mm；进样针规格有10 μL、25 μL、100 μL。全自动点样仪具有加热功能。当点样量较大时，或是溶剂较难挥发(如水溶液)，可选择加热方式点样，减少斑点扩散。点样台的高度可以调节，可点不同厚度的薄层板，无需调节点样头。全自动点样仪占用空间少，吸样、点样等全部为一整体，节约人力和时间。

在点样和用铅笔在薄层板上划线时，应注意不要破坏薄层板涂层。样品之间应有一定的距离，至少5 mm，以免样品交叉。点样器为一次性耗材，点完一种药品后应更换。

新手制作的薄层色谱图边缘效应严重、斑点拖尾，而有经验者制作的薄层色谱图无边缘效应、斑点无拖尾现象。检测人员应不断总结经验，以求得到较好的色谱图。

3.4 展开

展开剂如果各成分比例发生变化，会造成色谱斑点明显减少，影响实验结果。因此展开剂应严格按照兽药典检测方法说明的比例进行配制，现用现配，不能重复使用。配制时按比例将各试剂放入三角瓶，充分混匀，备用。若需分层，则按药典要求静置，取所需的上层或下层使用。展开剂通常含有挥发性试剂，因此一般在通风橱中操作。

展开剂选择的依据是根据溶剂极性大小，极性小的化合物用极性小的展开剂，极性大的则相反。在实际工作中，展开剂通常有2 种或2 种以上的溶剂，目的是调整展开剂的极性，改善色谱分离效果。Rf 值的范围应在0.2～0.7。展开剂根据其极性大小可分为3 种，弱极性溶剂体系：主要是正己烷和水，甲醇、乙醇或乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，适用于生物碱、黄酮、萜类成分的分离；中等极性溶剂体系：主要是氯仿和水，甲醇、乙醇或乙酸乙酯等来调节极性，适用于蒽醌、香豆素和一些极性较大的木脂素和萜类成分的分离；强极性溶剂体系：主要是正丁醇和水，用甲醇、乙醇或乙酸乙酯等来调节极性，适用于极性很大的生物碱类成分的分离。

薄层色谱专用的展缸，常用的是直立式双槽展缸。双槽展缸使用方便，便于预平衡和湿度控制，节省展开剂。展开时展开剂液面需在点样位置以下，展开剂使用前需充分混匀。展开后薄层板取出平放晾干，用铅笔划出展开剂前沿位置，距薄层板一端约2 cm。

展开缸应适合薄层板的大小，配有严密的盖子，底部平整光滑有双槽。展开时应在盖子与展开缸连接处涂抹凡士林密封，防止展开剂逸出，影响展开效果。

展开前如需溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭15～30 min，溶剂蒸气预平衡后应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，按照要求展开。

3.5 显色

薄层板展开后，如果展开的化合物斑点本身有颜色，可以直接观察，如果本身无色，可在紫外灯照射下观察，看有无荧光斑点。如果以上方法都观察不到斑点，则需要使用显色剂使展开的斑点显色。使用显色剂的方法有喷雾法和浸渍法，喷雾法是最常用的方法。喷雾时将适当的显色剂装入喷雾瓶，先对着通风橱试喷，待出雾成均匀细雾状后再对展板喷雾，喷雾时喷雾瓶应距展板有一定的距离。浸渍法是将展开后的薄层板垂直放入浸渍槽数秒钟，浸渍槽为扁的玻璃槽，取出展板后擦干背面的展开剂，晾干。

显色剂的选择应根据待检化合物的性质进行，如成分未知，选择硫酸作显色剂或铁氰化钾-三氯化铁试剂。前者与化合物产生氧化还原反应，按氧化程度不同呈现不同的颜色或荧光；后者与化合物反应呈现蓝色。已知成分选择显色好的显色剂，醛酮类用2,4-二硝基苯肼，黄酮类用三氯化铝乙醇溶液，氨基糖类用对二甲氨基苯甲醛。中兽药检测严格按照兽药典要求规范操作即可。应注意含有硫酸的显色剂，对薄层板喷雾时应控制用量，因为硫酸易使薄层板发黑，影响显色效果。喷雾时应均匀细致，喷雾不均匀也会影响显色。

检测仪器主要是紫外光灯，分365 nm 的长波段和254 nm 的短波段。365 nm 波段主要用于观察有荧光的色谱，254 nm 波段主要用于观察硅胶GF254 板在荧光背景下的荧光淬灭暗色斑点[5]。

3.6 温湿度

温度影响有机溶剂的挥发，Rf 值随温度升高而增大。温度会影响展开剂中各种溶剂蒸汽的比例，从而影响展开效果。因此应控制实验室温度，实验记录中准确记录温度。

湿度影响薄层板的吸附能力，从而影响分离效果。实验记录中也应准确记录空气湿度。

4 讨论

薄层色谱技术一直被很多分析工作者所关注，并被用于多个领域。但由于仪器的自动化程度低、分辨率及重复性不理想等问题，薄层色谱技术在较长时间内都停留在定性和半定量的水平上。直到1970 年代开始，薄层色谱向仪器化、高效化发展，逐渐形成了仪器化、现代化薄层色谱。现今，随着科学技术的迅速发展，薄层色谱也出现了很多新的技术类型，除了普通薄层色谱，还有高效薄层色谱、棒状薄层色谱(TLCFID)、加压薄层色谱(OPLC)、离心薄层色谱(CTLC)、胶束薄层色谱(M-TLC)、包合薄层色谱(ICC)、二维薄层(2D TLC)、超薄层色谱(UTLC) 等；薄层色谱技术与其他定量技术联用，有薄层-酸性染料比色法、薄层层析-紫外分光光度法、TLC-HPLC 法，可准确定性定量一些复方中兽药中的某些成分。薄层色谱也与现代高科技的分析技术相结合，如薄层色谱-傅立叶变换红外光谱联用检测、薄层色谱-拉曼光谱联用检测、薄层色谱-质谱联用检测、薄层色谱-核磁共振联用检测、薄层色谱-电化学方法联用检测等，使其成为一种更灵敏、高效的分离分析方法。应用领域涉及农业、医药、食品、橡胶工业、有机合成等，特别在医药领域中的药物分析和中药检验方面使用较多，今后，薄层色谱法仍将是经济、可靠、快速的重要分析方法之一[7]。

薄层色谱有很明显的优点，设备简单、操作简便、灵敏度高、专属性强、适用性广、成本相对低廉、可比性好、分离快速，可以快速给出可靠、准确的结果。薄层色谱也有其缺点，如仪器普及率低、设备不简单、结果重复性和稳定性差、鉴别速度较慢、展开剂毒性较大。容易受到薄层板质量、显色剂用量、加热条件、温湿度等外界因素和操作人员熟练程度的影响，实验结果易产生误差。我们对这些影响因素，应采取有效的解决方案，以确保检验结果的准确性和流程规范性。因此，薄层色谱技术在中兽药检测中的应用研究还需进一步加强。