临界性高血压中医病证结合动物模型研究进展

安慧妍,张 聪 综述 蒋天裕 审校

临界性高血压是指120～139/80～89 mmHg范围内的血压[1],与正常血压比较,临界性高血压能使心血管疾病发生率增高[2]。一项纳入451 755名成年人的调查显示,收缩压达到130 mmHg或舒张压达到80 mmHg的人群达到41.3%[3],因此有必要对临界性高血压进行有效干预,改善血压水平,防止或延缓临床高血压等心血管疾病发生。

中医药干预临界性高血压取得了一定效果,建立理想的临界性高血压中医病证结合动物模型可对其生理病理机制与中医药干预手段的研究提供技术支撑。临界性高血压中医病证结合动物模型是指血压处于正常高值同时表现出相应中医证型的动物模型。临界性高血压在病程、并发症等方面不同于高血压病,用于临界性高血压的干预方式不能作为降压药物的替代疗法,因此用于临界性高血压的动物模型也应当与高血压模型相区别。目前临界性高血压病证结合模型研究非常有限,亟需建立具有良好预测效度的临界性高血压中医病证结合动物模型,更好模拟临界性高血压患者的生理病理状态及对各种治疗手段的反应。本文就临界性高血压中医病证结合动物模型主要类型、目前存在的问题、构建原则、动物选择、血压值界定等方面进行综述,以期为临界性高血压中医药实验研究提供一些思路。

1 主要类型

临床上,临界性高血压的中医证型多样,田颖等[4]调查得到的常见证型有肝阳上亢、肝火上炎、痰浊壅盛、阴虚阳亢,刘振岳[5]通过德尔菲法得到的临界性高血压常见证型还包括阴阳两虚、瘀血阻滞、肝肾不足等。在以上证型中,现有报道成功复制的中医病证结合动物模型只有痰湿雍盛临界性高血压大鼠模型。贾蔷等[6]采用雄性Wistar大鼠,予高脂饲料+一氧化氮合酶竞争性抑制剂构建临界性高血压痰湿壅盛证大鼠模型,模型组大鼠血压在160/88 mmHg左右。郭晓庆等[7]采用4周龄雄性Wistar京都种(wistar-Kyoto, WKY)大鼠,以高脂饲料+8%盐水方式建立痰浊壅盛型临界性高血压大鼠模型,大鼠出现少动、肥胖、纳食减少等表现,血压在138/88 mmHg左右。叶建桥等[8]选用雄性WKY大鼠,给予高脂高盐饮食制备痰湿壅盛型临界性高血压大鼠,大鼠出现纳差、少动、便溏、体重增加、白胖舌、血脂升高等痰湿证表现,干预期间,正常血压大鼠血压在120 mmHg/80 mmHg以下,高盐高脂饮食干预的大鼠在10～20周的血压为120～140 mmHg/80～90 mmHg。

高血压动物模型中对于中医证候模型的构建方式可以作为研究临界性高血压中医病证结合模型的参考。如高血压肝阳上亢型采用自发性或肾性高血压模型大鼠,按照生药2 g/(kg·d)剂量灌服附子汤,连续4周。得到的大鼠除血压升高外,还具有饮水量增加、眩晕、易激惹的特点[9,10]。为了克服中药汤剂灌胃可能存在不同批次中药材品质、有效成分含量差别的问题,周梦等[11]将附子汤灌胃改为腹腔注射参附注射液,使造模药物有效成分剂量更好得以控制;气虚痰浊型高血压模型采用8周龄自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR),隔日予高脂饲料,每周6次力竭游泳,模型大鼠出现活动减少、皮肤松弛、大便不成形的特征,同时出现肥胖,血糖、血脂升高等指标的改变[12];肝热痰瘀型高血压模型选用雄性SD大鼠,方式为皮下注射环孢菌素A加附子、高脂乳剂,大鼠血压升高,并出现毛色黄、易激惹、纳少、唇舌质暗等表现[13]。

此外,另有一些无中医证候特征的临界性高血压模型,其建立方式有:(1)杂交。1988年Lawler等[14]采用雌性SHR与雄性WKY大鼠杂交,得到子一代临界性高血压大鼠。子一代大鼠较SHR血压上升幅度与上限降低。但随着饮食中氯化钠摄入量的增加,这种交界性高血压大鼠会发展为高血压[15],因此这种模型也被用于环境因素所致高血压、应激性高血压的研究[16]。有研究中采用雌性SHR和雄性Wistar大鼠杂交得到临界性高血压模型,给予正常饮食,12周时其收缩压与舒张压与对照组Wistar大鼠相比均有统计学差异,在此后的实验期间差异稳定存在,收缩压均值在120～130 mmHg,舒张压在80～90 mmHg,与人的临界性高血压血压值相近[17]。另外,也有少量研究用雌性Wistar与雄性SHR杂交得到临界性高血压大鼠[18]。杂交方式造模在国外研究中应用较多[19,20]。(2)饮食干预。王云彩等[21]对Dahl盐敏感(salt sensitive, SS)高血压大鼠以8%高盐饲料干预,血压达到临界高值时停用高盐饲料,魏肖禹等[22]、杨鹤丹等[23]的研究中采用相同的造模方式,但不同研究中高盐饲料的干预时间不同。采用Dahl/SS大鼠构建临界性高血压模型的优势是能够通过改变饲料控制大鼠血压的进一步上升,避免研究过程中临界性高血压模型演变为高血压模型。(3)刺激应激。贾文睿[24]用电击及噪声刺激大鼠,造模第3天起,大鼠收缩压上升至120 mmHg以上,在11 d的实验期间内,收缩压保持在120～140 mmHg,该方法造模所需时间短,但目前该种造模方式应用相对较少。(4)SHR模型。小周龄的SHR模型稳定的高血压还未完全形成,有研究用小周龄的SHR模型作为临界性高血压模型[25]。

2 目前存在的问题

2.1 与高血压模型区分不明确 目前更多研究集中于高血压模型,对于临界性高血压这种病前状态的关注较少,有一些研究中引入高血压模型作为临界性高血压模型[25]。高血压病与临界性高血压不仅是病程与血压值的区别,高血压还会产生靶器官损害,如肾性高血压模型能够模拟高血压肾损害,就不适宜引入用作临界性高血压模型;临床上不同血压水平适合不同干预措施,高血压病与临界性高血压的干预手段不能互相外推,因此引入高血压病证结合模型进行临界性高血压的研究具有诸多限制,需要严格把控条件,不能盲目直接应用。

2.2 血压值界定不统一 临界性高血压动物模型血压值的界定,对于造模是否成功、干预方案是否有效的判定至关重要,科学的血压值界定是保证临界性高血压机制与干预研究预测效度的前提。不同研究中对临界性高血压模型的血压值界定不统一,例如,Dahl/SS大鼠作为临界性高血压模型时,研究中报道的血压值有130～139/85～89 mmHg[21]、130～139/80～89 mmHg[22],SHR与正常血压大鼠杂交的临界性高血压大鼠的收缩压值有120～130 mmHg[17]、140～155 mmHg[26]、145～160 mmHg[27],不同研究中血压值差异较大。

部分研究将临界性高血压作为研究主题,但没有明确界定血压值,如Ajda等[25]直接将7～10周龄SHR用作临界性高血压研究。周巍等[28]认为SHR在4周后血压逐渐升高,12周形成稳定的高血压,所以可将4～12周的SHR作为临界性高血压大鼠,但4周时SHR收缩压均值为149.9 mmHg,12周时收缩压达到了184.3 mmHg,此时血压值是否仍属于临界性高血压范围缺乏科学的判定方法。

2.3 对中医证型模型的研究不足 临界性高血压的常见中医证型多样,而目前只建立了痰湿壅盛证的临界性高血压模型,没有相应的病证结合模型限制了临界性高血压的中医药研究。此外,辨证用药是中医治疗有效性的关键,部分中药干预临界性高血压的研究只辨病、不辨证,未进行中医证候要素的构建[29,30]。且目前研究中存在对模型辨证不清的问题,以高血压与临界性高血压的常见证型阴虚阳亢证与肝阳上亢证为例,构建阴虚阳亢证高血压大鼠模型采用的方法有灌服附子汤法[31,32]、夹尾刺激法等[33],而灌服附子汤法也是肝阳上亢证的常用造模方法[9],一虚一实的不同中医证型采用了相同的造模方法,这体现在模型的辨证上没有将阴虚阳亢与肝阳上亢模型进行准确区分。

3 构建原则

不同中医证型的同种疾病,其中医治疗可能截然不同,构建具有中医证候特征的临界性高血压模型对于临界性高血压的中医药实验具有重要的意义。临界性高血压病证结合模型,要在血压处于正常高值的基础上,能表现出相应证型的证候特征,最好有客观的生化指标能够佐证该证型。表现出的中医证候应当成功率高,易重复,在研究期间能够保持稳定。同时,模型在病理机制上应与人类临界性高血压相似,同时具备临界性高血压较高血压病程短、靶器官损害少、心脑血管事件发生少的特点,在临界性高血压的干预实验中应具有较好的预测效度,能够较好模拟各中医证型的临界性高血压患者对干预手段的反应。

在中医证候要素的建立上,造模方式应损伤小,尽量避免手术等较大创伤,以免对实验结果产生干扰;中医证候的建立方式应尽量避免对研究的关键指标,如血压、心率等产生影响;形成的证候应较为稳定,可重复性强;建立的证候模型能够较明显地表现出区别于其他证型的证候特征。例如,在临界性高血压的常见证型中,肝阳上亢与阴虚阳亢二证最易混淆,二证都存在肝阳亢的病理因素,肝阳上亢证以阳亢为主,阴虚阳亢证以阴虚为证候的主要方面,具有本虚标实证的特征,两种证型一实一虚,其动物模型在造模方式与证候表现上应进行区别。另外,证候模型的复制时应考虑所选用动物品系,现有单纯中医证候要素模型的构建方式能够作为参考,但不能将中医证候要素模型构建方式与临界性高血压动物模型简单叠加,例如,高脂饲料喂养能复制痰湿壅盛模型,但有研究报道采用该方法复制SHR痰湿壅盛型临界性高血压大鼠不能成功[6]。

临界性高血压大鼠模型可从以下几方面进行评价:(1)血压升高符合临界性高血压标准,血压高于正常大鼠,低于高血压病模型大鼠。评价内容包括造模成功率(处于临界性高血压范围的大鼠占该批大鼠的比率)和模型稳定性(在一段时间内模型组血压稳定处于临界性高血压范围内)。(2)在发病与病理机制上与人类临界性高血压相类,能够用于临界性高血压机制的研究。(3)模型预测效度较好,能够体现各证型临界性高血压的特征,模拟对应中医证型的临界性高血压患者对治疗手段的反应。

4 动物选择

绝大多数临界性高血压研究选用大鼠模型作为模型动物,少量研究选用小鼠[34]。可选择的动物有Dahl/SS大鼠、SHR、杂交大鼠模型等。

4.1 Dahl/SS大鼠模型 Dahl/SS大鼠由Dahl L K在1962年研制,给予高盐与三碘甲状腺原氨酸后,选出血压最高、最低的雌鼠与雄鼠,分别近亲繁殖后得到Dahl/SS大鼠与盐抵抗(salt resistant, SR)大鼠,SS大鼠若无特殊干预,其血压与SR大鼠无差异,给予高盐后,出现高血压特征[35]。给予高盐饲料后第5天,其收缩压就明显高于普通饲料大鼠[36]。但目前也有研究报道,低盐饮食情况下,Dahl/SS大鼠血压依然高于SR大鼠[37]。以Dahl/SS大鼠构建临界性高血压中医病证结合模型的优势在于血压达到预定值后,可以停止高盐饮食,使血压保持在临界性高血压的范围。仅通过改变饲料就可以控制模型动物血压,与常用的中医证候要素构建方式不存在冲突。Dahl/SS大鼠属于遗传性高血压大鼠模型,能够用于临界性高血压的分子遗传学研究,结合中医证候,进而指导高血压的精准防治;给予Dahl/SS大鼠不同浓度梯度的高盐饲料还能够用于临界性高血压饮食干预研究。利用Dahl/SS大鼠制备临界性高血压中医病证结合模型时,应每日监测血压,根据血压情况决定是否继续给予高盐饲料,同时可进行中医证候要素构建。其对照组可选择Dahl/SR大鼠,给予相同饲料。

4.2 SHR模型 有研究认为,自发性疾病模型通过遗传获得易感性,不需要致病因素诱导,相对于诱发疾病模型更适合于中医病证结合模型的研究[38]。SHR因其自发发病的特点与人类临界性高血压发病方式相似,更符合本病“原发性”的特点。SHR来源于WKY大鼠,使用SHR作为实验组时,对照组应选择WKY大鼠,不能随意选用正常血压大鼠。一些研究中将稳定高血压尚未完全形成的小周龄SHR用作临界性高血压模型,有研究报道,4周时易卒中型SHR收缩压为120 mmHg左右,高于WKY大鼠,研究者认为此时临界性高血压已形成,此后血压继续上升,20周后血压不再明显升高,稳定的高血压已形成,此时收缩压在240 mmHg左右[39]。SHR的优势在于大鼠血压自发升高,方便同时进行各种中医证候要素的构建,缺点在于SHR大鼠血压上升较快,难以控制。7周龄的SHR大鼠收缩压平均值已达到150 mmHg[40],在用于临界性高血压研究时,血压随研究时间升高,会超过临界性高血压上限,成为高血压病模型。此外,出生不久的SHR,血压就随月龄增加而升高,左心室重量高于正常大鼠[41],心肌纤维在14周时能发生显著改变[42],SHR会出现与临界性高血压特征不符的靶器官损害。因此选用SHR作为临界性高血压模型时,应从血压范围与靶器官损害出现时间方面对研究时间进行限制,尤其是当中医证候要素建立需要较长时间时,不宜选择SHR。并且温度、饮食等因素都会对SHR的血压产生影响,中医证候要素建立时如果涉及上述因素,应注意其对血压的影响,在研究中也应注意控制实验条件[43]。

4.3 杂交大鼠模型 采用SHR与正常血压大鼠杂交得到的子一代大鼠是可能的构建中医病证结合模型的潜力动物之一。SHR与WKY杂交大鼠的血压水平较SHR血压上升幅度小,血压上限更低,更符合临界性高血压要求[14],SHR来源于WKY大鼠,该种方式建立的临界性高血压模型对照组可选用WKY大鼠。也有研究中以SHR与Wistar大鼠杂交,对照组选用Wistar大鼠[17]。该杂交模型的血压也无需干预即可自发升高,可方便中医证候要素的建立。但需要注意的是,在环境刺激、压力刺激、饮食影响下,该模型会演变为永久性高血压,在研究过程中注意避免这些因素的影响,尤其要关注氯化钠的摄入量[15, 44],中医证候建立时若涉及到上述因素,有影响该模型血压、导致造模不成功的可能。

4.4 其他动物模型 应激性临界性高血压大鼠模型对于临界性高血压中医药实验也可能是一种有潜力的动物模型,这种模型造模损伤小,排除了注射、手术等有创操作本身可能造成的对血压的干扰,应激性血压升高的特点与当前人群亚健康致病状态贴合,临界性高血压的常见证型如肝阳上亢、肝火上炎、阴虚阳亢证的形成也与应激和情绪有一定关系[24]。但该模型目前研究较少,有待于进一步实验验证与优化,再进行与中医证候模型的结合。肾性高血压模型需要经过手术,存在肾缺血的病理基础,其中单肾单夹模型死亡率高,双肾双夹模型易产生心脑血管损害,不适宜用作临界性高血压中医病证结合模型的研究[45]。

此外,考虑到中医证候模型的建立,选择动物与诱导血压升高时应规避可能造成中医气血阴阳失衡的方式,以免干扰中医证候的制备,例如,高盐高脂饮食是一种制备高血压模型的方式,但这种方法同时会使大鼠具备痰湿证特征,会干扰其他中医证候的制备与研究。

综上,制备临界性高血压中医病证结合模型时,可优先选择Dahl/SS大鼠,其次为SHR与Wistar或WKY大鼠的杂交大鼠,必要时也可选择SHR。

5 血压值界定

在大鼠血压正常高值的界定上,不同研究间有一定差异,例如,采用Dahl/SS大鼠的研究以130～139/80～89 mmHg[22]、130～139/85～89 mmHg[21]作为正常高值血压标准[27,28],采用雄性高盐高脂饮食WKY大鼠的研究报道的血压在120～140/80～90 mmHg范围[8]。更多研究未提及血压界定值。不同品系动物基础血压值不同,对应的临界性高血压界值存在差异,对于一种新的临界性高血压模型动物,不能简单以人的临界性高血压界值界定,具体体现在:(1)随周龄变化,大鼠正常血压也发生较大变化,如雄性SD大鼠5周龄时收缩压均值为108 mmHg,19周龄时收缩压为139 mmHg[40],血压明显升高;(2)不同品系大鼠,血压值不同,如同为19周龄雄性大鼠,Wistar-Imamichi大鼠收缩压均值为129 mmHg,SD大鼠收缩压均值为139 mmHg[40],此时SD大鼠已达到人类临界性高血压的诊断标准,但不能认为SD大鼠在生长过程中自然形成了临界性高血压。

相较于固定的临界性高血压界值,模型动物模拟出各中医证型的临界性高血压病理特征更为重要,因此针对不同的造模方式、不同动物品系的临界性高血压中医病证结合模型,其界值有所差异。若选用Dahl/SS大鼠,可参考现有研究将血压临界值订为130～139/80～89 mmHg[22];若选用SHR与正常血压大鼠杂交的子一代自发临界性高血压大鼠,可将血压值界定为130～150/80～90 mmHg[17, 26, 27];选用WKY大鼠高盐高脂诱导痰湿壅盛型临界性高血压大鼠模型,血压值可界定为120～140/80～90 mmHg[7,8],选用Wistar大鼠时,血压界值应更高[6]。

6 结 语

全球高血压流行趋势综合分析报告显示,1990-2019年30～79岁患高血压病的人数成倍增长[46],因此在高血压前期更应及时干预,避免高血压病的形成。合理的动物临界性高血压血压值界定与适当的中医病证结合动物模型构建,对于开展本病的机制研究与中医药干预方案研究起着至关重要的作用。目前临界性高血压中医病证结合模型只有痰湿壅盛型被成功构建,另有杂交、饮食诱导、SHR模型等临界性高血压模型构建方法,高血压模型中的中医证候要素构建方式可以作为构建临界性高血压中医证候模型的参考。临界性高血压的中医病证结合模型存在未与高血压模型明确区分、血压值界定不统一、中医病证结合模型类型不完整的问题,尤其是多个常见中医证型的临界性高血压模型尚未被建立。理想的临界性高血压中医病证模型应当表现出稳定的临界性高血压范围与相应的中医证候特征,模拟各中医证型临界性高血压人群的病理特征与对各种干预的反应。构建中医病证结合临界性高血压大鼠模型时,可以优先选择Dahl/SS大鼠,其次是SHR与Wistar或WKY大鼠的杂交大鼠,必要时可选择SHR;在血压值的界定上,针对不同造模方式、不同品系动物,应制订不同的界值标准。在未来的研究中,应当针对不同造模方式制订模型构建与血压值界定的标准,根据人群中临界性高血压常见证候分布研发更多中医病证结合临界性高血压模型。