MicroRNAs在胰腺炎发病和治疗中的研究进展

刘涛涛 综述 张争运 审校

MicroRNAs(miRNAs) 是基因表达的重要调节因子,属于小的非编码RNA(small non-coding RNA)。诸多miRNAs参与调节胰腺细胞之间的信号转导,在胰腺腺泡细胞、胰腺星状细胞(PSCs)和免疫细胞之间构成一个复杂的分子调控互作网络。研究表明,miRNAs有助于胰腺炎诊断和治疗[1]。急性胰腺炎和慢性胰腺炎是一类发病率、住院率和病死率较高的炎症性疾病。与正常胰腺组织比,急性胰腺炎、慢性胰腺炎患者胰腺组织中miRNAs的表达异常[2]。miRNAs通过调节细胞因子和趋化因子的表达及细胞增殖、迁移、组织重塑从而影响胰腺纤维化(pancreatic fibrosis,PF)的发展[3]。单个miRNA可调节多个靶基因的表达,为有效治疗胰腺炎提供了可能。胰腺炎相关miRNAs调控网络分析表明:潜在的治疗靶点有hsa-miR-15a(CCND1)、hsa-miR-16(CCND1)、hsa-miR-155(CCND1/SMAD2)、hsa-miR-375(AKT2/CDK6)和hsa-miR-429(CCND1)[3, 4]。一些miRNAs可调控胰腺细胞内的信号通路,另一些则通过外泌体在胰腺腺泡细胞、胰腺星状细胞、PSCs、胰腺免疫细胞之间传递的信号分子。因此,研究胰腺炎病理生理学过程中的miRNAs表达,了解其与胰腺炎发生发展的相关性,有助于开发有治疗价值的anti-miRNA及miRNAs模拟物用于胰腺炎的治疗。本文对miRNAs在胰腺炎发病和进展中的作用及分子机制进行综述。

1 miRNAs在急性胰腺炎发生发展中的作用

1.1 miRNAs调节急性胰腺损伤时的炎症反应 胰腺消化酶过早激活会导致胰腺腺泡细胞损伤和炎症反应[5]。miRNAs对于维持胰腺细胞的完整性至关重要,参与调节急性胰腺炎炎症反应进展的多个环节[6]。miR-21在急性胰腺炎炎症、细胞凋亡和坏死中的作用已得到充分证实[6]。急性胰腺炎患者和健康受试者的血液样本对比研究表明,miR-21和miR-155在急性胰腺炎患者中的表达水平显著上调。小鼠模型也有助于阐明miR-21在急性胰腺炎相关肺损伤中的作用[7]。与对照组相比,雨蛙素急性胰腺炎模型小鼠的miR-21水平增加,miR-21KO组小鼠的淀粉酶水平较低[8]。与用雨蛙素处理的对照小鼠相比,雨蛙素处理的miR-21KO小鼠的Hnrnph1,Sgk3,Set,Pdcd10Pten和Pias3水平升高,Kpna2,Hmgb1,Cxcl13,Erbb4,Xiap,Gata3,Thbs1,Atg5,Atg7和Atg16的水平降低,Pias3上调与STAT3激活的抑制相关,Pias3为STAT3的负调节剂[9]。HMGB1协调炎症、免疫和细胞死亡的过程[10, 11]。重组Hmgb1(rHMGB1)处理外周血单核细胞(PBMC),miR-21表达增加。此外,雨蛙素处理miR-21KO小鼠,重组rHMGB1显著增加了小鼠肺损伤。以上表明HMGB 1和miR-21均参与调节急性胰腺炎期间炎症反应。另外,雨蛙素、L-精氨酸L-arginine和脂多糖(LPS)等多种急性胰腺炎动物模型中,证实了miR-21的表达上调,miR-21与急性胰腺炎中细胞坏死密切相关,miR-21通过调节胰腺腺泡细胞在急性胰腺炎过程中的内在反应来发挥其功能[6,12]。

胰腺腺泡细胞与免疫细胞之间的信号转导在急性胰腺炎疾病进展中的起关键作用。来源于雨蛙素处理的胰腺腺泡细胞外泌体EV可诱导巨噬细胞浸润,加重急性胰腺炎大鼠模型的损伤[13]。损伤胰腺腺泡细胞来源的外泌体EV载有miR-183-5p,通过直接抑制Foxo1,诱导M1巨噬细胞极化并刺激淀粉酶和脂肪酶的产生,导致NF-κB通路的激活和IL-6和TNFα水平升高[13]。与健康人相比,来源于急性胰腺炎患者血液样本外泌体EV中miR-183-5p水平升高[13]。

长链非编码RNA(lncRNA)与miRNAs之间的相互作用可以介导急性胰腺炎期间胰腺的反应。一项关于大鼠急性胰腺炎模型结果表明,miR-365a-3p的水平被下调,而lncRNA NEAT1在发生急性胰腺炎时上调[14]。雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J,miR-365a-3p的表达上调,TNFα、IL-1β和IL-6等炎症标志物表达降低。lncRNA NEAT1-siRNA可降低lncRNA NEAT1的表达水平,增强miR-365a-3p表达并降低炎性细胞因子水平[14]。Song等[15]研究表明,在急性胰腺炎的小鼠模型中,miR-361-5p和IL-17的水平在血清和损伤胰腺组织中显著增加。miR-361-5p在Th17细胞中的过表达,导致miR-9、146-3p、365-3p 和 183-5p表达增加。

研究表明,雨蛙素作用于过表达miR-9和miR-146b-3p大鼠胰腺腺泡细胞,炎症反应减轻,Il-1β,IL-6,TNF-α表达和凋亡水平的降低[16, 17],证明miR-9和miR-146b-3p在急性胰腺炎中有保护作用。Fgf 10在急性胰腺炎损伤中的表达上调可导致IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α表达增加而诱导凋亡,凋亡相关蛋白bax、caspase 3和9表达上调,抗凋亡作用bcl-2蛋白质表达下调。miR-9直接靶向Fgf 10,从而阻止NF-κB信号的激活和减少炎症反应[16]。生物信息学分析确定了Annexin A2 mRNA 3 UTR区miR-146 b-3p的结合位点,体外实验表明Annexin A2是miR-146b-3p的下游靶基因[17]。急性胰腺炎患者血清Annexin A2水平与miR-146b-3p呈负相关。过表达miR-146b-3p的大鼠胰腺腺泡细胞经雨蛙素诱导后,AnnexinA2的表达水平降低;Annexin A2过表达抑制miR-146 b-3p的功能。并导致IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高[17]。

1.2 在细胞自噬和线粒体自噬调节中的作用 细胞自噬是一个分解代谢过程,细胞自噬可去除和回收自身受损细胞器,自噬的过程可分为选择性和非选择性。线粒体自噬属选择性自噬,可以清除受损的线粒体[18]。离体胰腺腺泡细胞株AR42J细胞模型证实,牛磺胆酸-3-硫酸盐(taurolithocholic acid-3-sulfate,TLCs)可诱导炎症、自噬受阻[19],证明miRNAs靶基因参与急性胰腺炎相关的细胞自噬和线粒体自噬。此外,TLCs诱导的细胞,炎性细胞因子TNFα、IL-6 mRNA和蛋白表达水平及自噬标志物LC3-II/I增加,而P62表达下调[19]。相反,过表达的miRNA-146a-5p逆转了TLCs的影响。同样,下调Irak1或Traf6表现出与miR-146a-5p过表达相似的效果,表明miR-146a-5p的过度表达抑制TLCs诱导的炎症和自噬是通过抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB 信号通路来实现的。

在雨蛙素诱导的AR42J细胞中过表达miR-92b-3p,可抑制炎症和自噬[20]。过表达miR-92b-3p可下调TNFα和IL-6、Traf 3的表达。荧光素酶活性测定结果表明,IL-6是miR-148A的直接靶基因,IL-6的表达可被miR-148A过表达抑制[21]。miR-92b-3p和miR-148 A的过表达可下调Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平[20, 21]。然而,在体内小鼠模型中,miR-155的表达下调后,Beclin 1的表达降低,Tab2表达上调,使急性胰腺炎进展期炎症及自噬受损减轻起保护作用[22]。

Ji等[23]发现,Atg7过表达通过抑制miR-30b-5p促进CAMKII的激活。ATG7过表达增强自噬、促进坏死,是由miR-30b-5p/CAMKII信号通路介导的[23]。CAMKII可以作为一种治疗靶标用于急性胰腺炎治疗,利用miRNA的生物信息学和组织微芯片分析证实,miR-30b-5p是急性胰腺炎相关CAMKII的一种负调控因子[23]。用急性胰腺炎患者和体内小鼠雨蛙素模型进行的研究表明:在急性胰腺炎患者和小鼠血清中miR-325-3p水平显著降低[24]。TargetScan在线数据库分析及实验证实,RIPK 3 3’UTR区有miR-325-3p的结合位点。此外,miR-325-3p过表达,导致另一种坏死性调节因子MLKL的磷酸化降低。总之,MiR-325-3p可抑制腺泡细胞中的RIPK 3/MLKL信号通路。

1.3 参与胰腺炎发病过程中活性氧ROS及肠黏膜屏障通透性的调节 细胞内的ROS可以增加细胞的氧化应激,导致细胞和组织中氧化和抗氧化系统的失衡[25]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种重要的抗氧化酶,能减少细胞及体内多余的活性氧。SOD能保护组织免受超氧阴离子的损伤。黄芩苷具有抗氧化和抗凋亡的影响,可能有预防急性胰腺炎的保护作用。研究表明,黄芩苷对AR42J细胞氧化应激、活力、凋亡和死亡率无实质性影响[25]。但是,低浓度的黄芩苷可下调miR-136-5p的表达、上调SOD1 mRNA和蛋白表达,使急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞活性氧ROS减少,凋亡增加,腺泡细胞数量死亡减少。黄芩苷使促凋亡的蛋白质表达上调,抗凋亡的蛋白质表达减少。黄芩苷也能减少雨蛙素诱导的AR42J细胞凋亡,而miR-136-5p抑制剂则作用相反。黄芩苷治疗使淀粉酶水平的下降,胰腺细胞损伤,且胰腺腺泡细胞死亡减少。所以,黄芩苷对胰腺腺泡细胞有保护作用机制有必要进行更深入地研究。

肠黏膜屏障主要结构是紧密连接,主要由 occludin,Claudin和连接粘附分子组成[26]. 研究表明,上调miR-122、occludin下调,急性胰腺炎大鼠模型肠通透性增加[26]。急性胰腺炎大鼠血清中IL-1β、TNFα、IL-6及内毒素水平均升高。抑制miR-122表达,导致occludin闭塞蛋白表达水平增加。miR-122可直接与occludin3’UTR结合。通过抑制miR-122表达,上调表达闭塞蛋白,可降低急性胰腺炎患者肠黏膜屏障通透性。

2 miRNAs在慢性胰腺炎中的作用

受损胰腺腺泡细胞、免疫细胞和PSCs之间的信号转导与慢性胰腺炎的进展密切相关。受损的胰腺腺泡与免疫细胞之间的交互作用可增加炎症反应,导致PSCs的活化和纤维化的发展和进展[27]。新近研究表明,miRNAs在调节参与PSCs损伤的基因转录中起着重要作用。miRNAs通过外泌体的细胞外信号转导允许胰腺腺泡细胞影响PSCs活性。miRNAs通过纤维化、凋亡和自噬等方式调节PSCs激活。研究表明,miR-15b/miR-16水平在慢性胰腺炎发展和进展时降低,并与α-SMA和BCL-2水平负相关[28]。有研究表明,大鼠采用HDAC抑制剂(伏立诺他和曲古抑菌素A)治疗,可减轻慢性胰腺炎的纤维炎症,降低血清IL-6和TNFα水平及降低活化的PSCs标记物(如GFAP和α-SMA)水平[29]。同时,Vorinostat治疗增加了miR-15/miR-16并诱导PSCs凋亡。miR-15/miR-16的过度表达降低了SMAD5、TGFβ通路效应子和BCL-2的表达[28,29]。

TGFβ信号通过诱导几种基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂的表达,在慢性胰腺炎期间激活PSCs中发挥作用,导致细胞外基质重塑、胶原纤维沉积和组织硬度增加。Zhang等[30]发现,TGFβ增加lnc-PFAR水平,然后与未成熟的miR-141-5p结合,阻断其成熟,并激活PSCs中的纤维化和自噬。此外,miR-141-5p通过与视网膜母细胞瘤卷曲螺旋蛋白1的3’UTR结合,抑制ULK1去磷酸化并减少自噬来防止自噬。然而,在慢性胰腺炎中,miR-141-5p的水平下调,因此,PSCs的纤维化和自噬增加。MicroRNA-30b-5p 可能通过抑TLR4/NF-κB 通路的表达,从而减弱 LTC-14 细胞炎症反应、改善纤维化。OM 对 LTC-14 细胞炎症反应、纤维化的调节可能是通过影响 microRNA-30b-5p 而实现的[31]。

一项研究结果显示,结缔组织生长因子2 (CTGF/CCN2)和慢性胰腺炎中miR-21之间的正反馈环[32]。另有研究表明,CTGF是由乙醇、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、PDGF和激活素信号诱导[33],证明CTGF水平的增加与miR-21和纤维形成的增加呈正相关。值得注意的是,miR-21正调节CTGF转录,并提供自我调节的自分泌模式。从PSCs收集的外泌体包含CTGF和miR-21,CTGF和miR-21的过度表达明显增加这两种因子在外泌体中的水平。还有研究发现,活性氧 /miR-21轴促进PSCs活化和糖酵解[34],表明过氧化氢诱导miR-21表达,而用白藜芦醇(RSV)或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)治疗则抵消了其在PSCs中的诱导作用。miR-21的下调抑制了活性氧诱导的PSCs活化、迁移和侵袭。此外,它还减少糖酵解酶,如葡萄糖转运蛋白1、己糖激酶2、丙酮酸激酶M2和乳酸脱氢酶A[35]。这些研究表明,通过直接抑制miR-21或用RSV治疗PSCs来减少乳酸分泌。

3 miRNAs作为胰腺炎的生物标记物及治疗中的作用

近十年的广泛研究证实,miRNA参与胰腺炎的发生发展。各种动物体内外模型及胰腺炎患者临床研究证实miR在急性胰腺炎和慢性胰腺炎中的功能意义[35]。miR-21和miR-155在急性胰腺炎的发病中至关重要,并可能作为胰腺炎的生物标志物[7]。在雨蛙素处理大鼠胰腺损伤后,血清中检测到miR-216a/b和miR-217表达上调[36, 37]。此外,雨蛙素诱导大鼠和犬引起急性胰腺损伤,miR-216a和miR-375 在表达升高[38, 39]。基于大鼠和犬的胰腺损伤研究表明,miR-216a、miR-217和miR-375是胰腺损伤和胰腺炎最有希望的候选生物标志物。

从血清中鉴定miRNAs,可作为慢性胰腺炎的鉴别诊断生物标志物[40-44]。有学者对77例患者血清标本进行研究发现,miR-210-3p的表达是一种非侵入性的生物标志物,可区分PDAC和慢性胰腺炎[40]。另一项研究报告发现,患者血清样本中的miR-221(AUC=100%)和miR-130 a(AUC=87.5%)可用于慢性胰腺炎的早期诊断[41]。一项对15例慢性胰腺炎患者血浆源性外泌体EV miRNAs的水平调查发现,与健康对照组相比,慢性胰腺炎患者miR-579-3p的表达水平明显减少[42]。另外,一项对90例PDAC及慢性胰腺炎患者的EV样本的研究表明,miR-95-3p与PDAC、miR-26b-5p与胰腺炎有关,miR-95-3p/miR-26b-5p及CA-19-9可以用于慢性胰腺炎与PDAC患者的鉴别诊断,miR-335-5p/miR-340-5p与PDAC转移和预后不良有关[43]。还有研究发现,与健康对照者、慢性胰腺炎患者比较,1型自身免疫性胰腺炎患者(AIP)的miR-21-5p表达水平明显增加[44]。

目前,对于血浆或血清中循环miR作为胰腺炎的生物标志物的研究已广泛开展。Hamada等[45]使用miRNA寡核苷酸芯片阵列技术研究了AIP患者血清样品中miR的表达,发现miR-150-5p表达显著升高,轻中度急性胰腺炎患者miR-216a水平均显著升高。Blenkiron等[46]报告了12例不同严重程度(轻度和重度)的急性胰腺炎患者血清中miR-92b、miR-10a和miR-7表达下调,此外,miR-551 b-5p和miR-126a-5p表达水平可区分重度急性胰腺炎和轻度急性胰腺炎 。轻中度和重度急性胰腺炎人群大型队列研究表明。与轻中度急性胰腺炎患者比,miR-7表达水平在重症胰腺炎中明显升高 。

综上,胰腺炎发生发展进程中,miRNAs可影响炎症反应及PSCs激活、迁移和侵袭。此外,miRNAs可影响胰腺腺泡细胞的增殖、凋亡和坏死;诱导或抑制胰腺炎病生理学进程。根据目前的研究资料及数据,miRNAs作为诊断生物标志物中具有应用价值,也可能成为治疗胰腺炎的关键候选靶分子。