细胞外基质蛋白调控多发性硬化症髓鞘再生的研究进展

杨 璐， 张 宁， 魏爽爽， 王思齐， 顾金海， 牛建国， 王 鹏

（1.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院病理科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004； 3.宁夏医科大学，银川 750004）

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由多种大分子构成的复杂网络结构，自然沉积在细胞周围，为细胞提供支撑和附着点[1]。ECM 在细胞存活、迁移、增殖、分化和基因表达过程中起着重要作用，形成神经细胞生长的微环境。ECM 蛋白组装缺陷、产量减少或ECM 蛋白过度积累与病理有关。在各种神经变性和神经炎性疾病中，ECM 的组合物发生明显改变。多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种由免疫系统介导的慢性中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病[2]。CNS 脱髓鞘后，广泛的ECM 重塑导致其表达谱在慢性MS 病灶中发生改变。研究[3]发现，纤粘连蛋白（fibronectin，Fn）以聚集体的形式持续存在，阻碍少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）的分化，从而抑制髓鞘再生。在正常情况下，髓鞘再生是脱髓鞘后的自然反应，这有赖于损伤组织的ECM 重塑，但在慢性和进展性MS 中，ECM 重塑往往失败。ECM 重塑受到多种蛋白质和酶的严格调控，其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是细胞外基质调控系统中一个重要的蛋白酶家族[4]，是已知的可降解纤粘连蛋白聚集体（fibronectin aggregates，aFn）的酶[5]。在MS 中，多种细胞外基质蛋白表达谱发生改变，同时参与髓鞘再生的调控。本文就细胞外基质蛋白调控MS 髓鞘再生的研究作一综述。

1 MS 病理特征

MS 是一种慢性CNS 炎症性和退行性疾病，该病会导致脱髓鞘和神经变性[6]。MS 早期被归类为器官特异性T 细胞介导的自身免疫性疾病，然而B 细胞靶向治疗的成功推翻了这一观点[7]。现已明晰环境因素和易感基因与该病的发病有关。MS 的典型病理特征是静脉周围炎性病变，形成脱髓鞘斑块，但病因尚不清楚。活动性斑块最常见于疾病早期，而在后期则以不活动性阴影斑块为主[8]。炎性浸润中含有T 淋巴细胞，以MHC-Ⅰ类限制性CD8+T 细胞为主，也有少量的B 细胞和浆细胞[9]。炎症会导致少突胶质细胞损伤和脱髓鞘[10]。在疾病的早期阶段，轴突保存相对完好，但随着疾病的发展，轴突会出现不可逆转的损伤。活动性MS 往往伴有严重的淋巴细胞性炎症。脱髓鞘和神经变性与损伤组织中巨噬细胞积聚和小胶质细胞激活有关[11]。在正常情况下，未被激活的小胶质细胞有助于维持神经系统的稳定性，而小胶质细胞一旦被激活，就会维持炎症反应，如碎片吞噬和清除、生长因子的形成和神经元回路的成形等[12]。浸润的巨噬细胞产生大量的炎症介质，在自身免疫性疾病中发挥着核心作用。除了神经保护功能外，激活的小胶质细胞还能造成神经损伤,包括产生细胞因子、趋化因子、一氧化氮和活性氧，这些都会推动疾病的发展。细胞因子，如白细胞介素-1b 和肿瘤坏死因子-a，以及活性氧可以激活丝裂原活化蛋白激酶，导致MMPs 转录增强及MMPs 水平的组织抑制剂减少，从而导致细胞外基质重塑[13]。

2 MS 中细胞外基质重塑

ECM 是由多种糖蛋白和蛋白多糖等组成的复杂网络，各组分共同作用构成动态平衡的微环境，积极参与和控制细胞生长、极性、形状、迁移和代谢等活动[14]。CNS 损伤后，ECM 的表达发生变化，即ECM 发生广泛的重塑[15]。在大多数情况下，髓鞘再生是脱髓鞘后的自然反应，但在慢性和进展性MS 中，ECM 重塑往往失败。在脱髓鞘性疾病MS 中，ECM 的动态重塑，即ECM 分子瞬时表达或降解，是调控损伤组织中少突胶质细胞成熟、分化的有效机制，并与髓鞘再生密切相关[16]。OPCs 在发生脱髓鞘时被激活，开始增殖和迁移，汇集到脱髓鞘区域，随后分化为成熟的少突胶质细胞，重新形成包裹神经元的轴突髓鞘，实现髓鞘再生[17]。

层粘连蛋白（laminin，Ln）是存在于动物基底膜的大细胞黏附性异三聚体蛋白糖蛋白。在活动性和慢性MS 病变中，Ln 于髓鞘膜形成初始出现在轴突周围，表达增加。在CNS 白质脱髓鞘时，Ln 表达亦上调。研究[18]表明，神经元脱髓鞘后，Lnα2 的表达和分泌能促进OPCs 的分化，从而促进髓鞘再生。Lnα1、Lnα2、Lnα4 和Lnα5 链在血管周围表达，Lnα 链阳性血管上附有OPCs。研究[19]表明，使用重组层粘连蛋白E8s（laminin E8s, LME8s）促进了OPCs 的迁移，并且通过激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）延长LM411E8 或LM511E8 上的OPCs 生存期。即表达在周围血管OPCs 中的Ln，通过整联蛋白β1-FAK 途径正向调节OPCs 的迁移和存活。

腱生蛋白C（tenascin C，Tn-C）是由单体通过二硫键组装而成的大型六聚体糖蛋白。Tn-C是星形胶质细胞外基质的功能成分，在发育的大脑中大量表达，随着机体发育成熟而消失，可干扰髓鞘碱性蛋白的表达和髓鞘片的形成[20]。此外，在活性MS 病变中，Tn-C 显著下调，甚至延伸至病灶边缘以外。而在非活性MS 病灶中心，Tn-C的水平几乎与脑白质相似，在病灶边缘则降低。分子质量为68 kDa 的RNA 结合蛋白（SRC associated in mitosis of 68 kDa，Sam68）是一种由少突胶质细胞合成的细胞内信号转导及RNA 激活蛋白。下调Sam68 可延迟髓鞘碱性蛋白的表达，过表达Sam68 则有利于OPCs 的分化。而Tn-C 可通过下调Sam68 来影响髓鞘碱性蛋白的表达，控制OPCs 的分化[21]。

此外，在慢性脱髓鞘MS 病变中，星形胶质细胞衍生的高分子质量透明质酸（hyaluronan，Ha）可以抑制OPCs 的成熟。虽然在健康的成人组织中不存在Fn，但Fn 在MS 中，尤其是在血管周围和CNS 实质中表达上调。

3 Fn 聚集体抑制MS 髓鞘再生

Fn 是由单一基因产生的高分子质量糖蛋白[22]，有两种类型：血浆纤粘连蛋白（plasma fibronectin，pFn）和细胞纤维粘连蛋白（cellular fibronectin，cFn）。pFn 是一种在外周循环中由肝细胞产生的可溶性化合物。cFn 是在局部产生的不溶性化合物[23]。

在MS 病变中，pFn 和cFn 组装成稳定的纤维粘连蛋白聚集体（fibronectin aggregates，aFn）。Fn 是机体损伤后，组织瞬时产生的一种ECM 成分，与其他ECM 成分结合形成基质，通过整合素受体调节细胞迁移和增殖。在健康成人CNS 中，Fn 仅定位于血管中，在间质ECM 中不存在。在各种实验性毒素诱导的髓鞘损伤模型中，Fn 在CNS 白质和血管中表达均增加，且其含量随着髓鞘再生的进行而减少[3]。

在白质MS 病灶的血管周围浸润组织中，pFn 和cFn 的表达持续增加。在溶血磷脂诱导脱髓鞘过程中，星形胶质细胞是cFn 的主要来源。但在MS 皮损中，Fn 不仅来自反应性星形胶质细胞，还由血浆渗漏产生，因此Fn 在脱髓鞘区域表达增加。在体外，二聚体Fn 介导OPCs 迁移和增殖，而Fn 涂层可扰乱OPC 生长，阻止髓鞘膜的形成。研究[24]发现，Fn 特异性地定位于脱髓鞘区域，并在髓鞘再生时被清除。而在实验脱髓鞘中，Fn 在慢性MS 皮损中持续存在。aFn 与二聚体Fn作用相似，在单独细胞培养的OPC 中加入aFn，会抑制髓鞘膜和髓鞘形成。胼胝体内注射aFn 可抑制毒素诱导的脱髓鞘病变中的OPC 分化和髓鞘再生，意味着Fn 聚集导致MS 患者髓鞘再生失败[3]。Fn mRNA 在慢性MS 皮损中几乎不存在，aFn 是在细胞外形成的，表明Fn 聚集的原因是Fn 的清除受阻，而不是Fn 的表达上调。尽管二聚体Fn 促进脱髓鞘后的OPCs 增殖，但选择性地从病变部位去除星形cFn，即使OPCs 数量减少也足以成功地进行髓鞘再生。因此，在CNS 白质脱髓鞘后，Fn 的瞬时表达先于髓鞘再生，有益于OPCs 的招募，但病理性的aFn 会抑制MS 病变的髓鞘再生。

aFn 诱导骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞释放一氧化氮增加，此过程不依赖于整合素，可能是由于聚集体中其他蛋白质，如使用aFn 作为支架的热休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）的积累。当巨噬细胞与aFn 共孵育时，观察到巨噬细胞的经典和替代激活表型增加。类似于aFn，细胞外Hsp70 显著增加了巨噬细胞中i－NOS 的表达。同时，暴露于细胞外的Hsp70 也使巨噬细胞中交替激活的标记精氨酸酶-1 的表达比原先增加3 倍[25]。Hsp70 通过转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信号转导增加胶原（collgen，Col）和Fn 的表达。细胞外的热休克蛋白90β（heat shock protein 90β，Hsp90β）直接与Fn 结合，促进不溶于脱氧胆酸盐的aFn的形成。Hsp70 和Hsp90β 与MS 的病理相关[12]。这些热休克蛋白对于MS 病变中aFn 的作用仍有待确定。

研究[26]表明，GD1a 可通过激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）克服aFn 对髓鞘再生的抑制作用；激酶活性分析显示，GD1a 激活了依赖PKA 的信号通路，促进了转录因子cAMP 反应元件结合蛋白的磷酸化。外源性加入神经节苷脂GD1a，经PKA 依赖的信号通路促进OPCs 成熟，从而消除aFn 对髓鞘再生的抑制。

硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs） 被认为与髓鞘再生失败、OPCs 分化和神经元生长有关。在实验性毒物性脱髓鞘啮齿动物模型中，脱髓鞘时，CSPGs 在MS病变的间质ECM 中表达上调，而在白质MS 病变中心表达下调。因此，鉴于Fn 聚集在慢性MS病变中，CSPGs 聚集在（慢性）活动性MS 病灶边缘，必须消除这些抑制髓鞘形成的障碍或绕过它们，才能使髓鞘再生。

在受损的CNS 中，MMPs 有促进ECM 重塑的作用[27]，而MMPs 功能失调会导致出现几种炎症性脱髓鞘疾病，包括MS 的发生和发展[28]。MMPs通常由前域、催化域、铰链域与血凝蛋白域组成，不同种MMPs 的结构有细微差异，故具有一定的底物特异性，但这并不是绝对的。同一种MMPs可降解多种ECM 成分，而某一种ECM 成分又可被多种MMPs 降解，但不同酶的降解效率不同[29]。MMPs 是已知的可降解aFn 的酶，降解aFn 有助于神经系统的发育[30]。

研究[5]证明，MMP7 可以裂解aFn，形成一个含有13 kDa EⅢA（16 kDa EDA）的片段。被IL-4激活的小胶质细胞和巨噬细胞是proMMP7 的主要细胞来源。在MS 病变中，proMMP7 水平降低，aFn 持续存在。proMMP7 在慢性MS 病变中的表达与有髓鞘病变相比较弱。因此，在慢性MS 病变中局部靶向上调MMP7 水平可能是清除抑制髓鞘再生的aFn 的第一步。

MMP3 在蛋白水平层面上也被称为基质溶素-1，主要由星形胶质细胞表达，也可由受损的神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞产生[31]。研究[32]发现，MMP3 蛋白存在于活动性及慢性MS病变的肥大星形胶质细胞、活动性病变的小胶质细胞/巨噬细胞，以及活动性和混合活动性/非活动性MS 病变的血管中。MMP3 可以通过调节多种信号通路，或降解抑制少突胶质细胞分化和成熟的成分，如CSPGs 和Fn，以及髓鞘碎片等促进少突胶质细胞分化和髓鞘生成。同时，MMP3 是其他MMPs 的有效激活剂，如MMP7 和MMP9等。

MMP9 也称明胶酶B，是MS 中被研究最多的MMPs 之一。将重组MMP9 注射到CNS 实质中会导致血脑屏障的破坏、神经元和髓磷脂的丢失[33]。源自白细胞的MMP9 可切割髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP），并可能参与髓磷脂膜的降解。然而，MMP9 对髓鞘再生的影响是双重性的，其也存在有益作用，比如巨噬细胞和小胶质细胞在再生阶段产生的MMP9 会降解NG2，NG2 是OPCs 上存在的一种跨膜硫酸软骨素蛋白多糖，可抑制少突胶质细胞的成熟。

在脱髓鞘时，MMP12 mRNA 主要由小胶质细胞/巨噬细胞产生。在这一阶段，MMP12 可能通过ECM 重塑和髓磷脂膜变性（髓磷脂的主要成分之一）参与巨噬细胞的迁移。在MS 病变的蛋白质水平层面上分析的其他MMPs，包括MMP1、MMP19 和MMP28 等。MMP1 在MS 病变中由大多数巨噬细胞中表达。MMP19 在健康成人CNS中由小胶质细胞组成性表达，在MS 活动性病变和活动性/非活动性病变边缘的实质和血管周围区域的巨噬细胞中高表达，也通过反应性星形胶质细胞表达。MMP28 主要在神经元中表达，是髓鞘形成和巨噬细胞招募的负调控因子，为进一步研究该蛋白提供证据。MMPs 在病变早期会导致损伤加重，而在后期MMPs 的缺失不利于间质ECM 重塑，后者对髓磷脂的再生至关重要。