抑癌基因Smad4/DPC4 在结直肠癌中作用的研究进展

苏进达， 张海明， 赵少辉， 邢林帅， 张金枫， 谢小亮

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院结直肠外科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004）

据全球癌症流行病学数据库（GLOBOCAN）2020 年统计数据显示[1]：结直肠癌（CRC）是全球最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，其发病率居于恶性肿瘤第3 位，死亡率高居第2 位。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库报道[2]Smad4/DPC4 的突变频率为10%，是CRC 中最常见的突变基因之一。Smad4/DPC4 是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路的中心介质，TGF-β 信号通路在细胞生长、分化、凋亡、迁移以及肿瘤的发生、发展等生物学过程中起着重要作用。因此，当Smad4/DPC4 缺失或突变时，伴随着TGF-β 信号传导的丧失，会导致不受控制的细胞增殖。现就Smad4/DPC4 在CRC 发生、发展、转移及治疗中的作用进行综述。

1 Smad4/DPC4 基因与蛋白的结构和功能

Smad4 基因位于染色体18q21.1，是一种抑癌基因，是Smads 家族中最常发生基因突变的基因之一。Smad4 基因包含12 个外显子和10 个内含子，该基因编码的蛋白质由552 个氨基酸组成，分子质量为60 KD。Smad4 蛋白的一级结构由3个主要部分组成，包括N 端MH1 结构域、C 端MH2结构域以及中间连接区。根据Smads 的结构和功能，可分为3 个亚型：受体激活型Smads（RSmads、Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8），抑制型Smads（I-Smads、Smad6、Smad7），共同调节型Smads（Co-Smads、Smad4）。转化生长因子β 超家族是一大类分子，主要包括TGF-β 亚家族和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）亚家族，当TGF-β 和BMP 配体与靶细胞表面的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，BMP Ⅰ型受体磷酸化Smad1/5/8，而TGF-β Ⅰ型受体磷酸化Smad2/3，活化的R-Smads 与Smad4 形成异聚Smad 复合物转移入核，在细胞核中募集相关转录激活因子或抑制因子调控靶基因反应。此外，抑制型Smads 可通过与R-Smads 竞争性结合Ⅰ型受体或通过与Smad2/3 竞争性结合Smad4 来负调节信号传导[3-7]。TGF-β 和BMP 亚家族中的许多成员在各种癌症中起着重要作用。

2 Smad4/DPC4 与CRC 上皮间质转化

上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞特性减少，间质特性增加，细胞骨架重塑和细胞基质黏附消失，转化为具有迁移和侵袭能力的间充质细胞的过程[8]。EMT 与肿瘤的转移、侵袭相关，Smad4 突变在CRC 后期促进肿瘤细胞发生EMT。EMT 主要由Snail 锌指蛋白、锌指E 盒结合蛋白、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子进行调控。Smad4 可通过调控这3 类转录因子表达，加速CRC EMT 过程，影响CRC 的迁移和侵袭。TGF-β 信号可通过TGF-β/Smad4 途径介导Smad2/3/4 复合物向细胞核易位，诱导间充质分子标记物Snail、Slug、Twist 和Zeb 的表达，从而诱导EMT[7]。Ioannou 等[9]运用免疫组化检测CRC 标本，发现Smad4 与Snail-1、Slug、Twist-1 的表达呈正相关，与E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达呈负相关，结果表明，Smad4 是结直肠癌EMT转变的一个核心成分，它与转录因子结合，降低E-钙黏蛋白表达并改变上皮细胞表型。除了经典TGF-β/Smad4 途径之外，Smad4 还可以通过非经典途径调控结直肠癌EMT。刘中财等[10]证实，在CRC 中Smad4 高表达可通过阻止PI3K/AKT通路抑制EphA2 的活化，从而阻止EMT 的发生，减弱癌细胞的迁移和侵袭能力。Xiao 等[11]发现，溶瘤腺病毒CD55-Smad4 通过调控Wnt/βcatenin 通路抑制结直肠癌EMT，从而抑制CRC细胞的迁移和侵袭。以上研究强化了Smad4 在结直肠癌EMT 过程中的作用，为有效治疗CRC 提供了理论依据。

3 Smad4/DPC4 与CRC 炎症微环境

肿瘤炎症微环境被世界公认为癌症发生和进展的标志之一。在肿瘤进展后期，炎症反应相关因子表达的增加可促进肿瘤的扩散和转移。Smad4 缺失可通过调控趋化因子表达募集炎症反应相关因子和肿瘤相关炎性细胞，促进CRC进展。Inamoto 等[12]发现，Smad4 缺失通过CCL15-CCR1 轴招募CCR1+骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）促进CRC 进展。人类MDSCs 包括单核细胞MDSCs 和粒细胞MDSCs 两个亚型群，MDSCs 群体是CRC 恶性进展中重要间质成分之一。梁倩[13]进一步研究发现，TRIM47 可以与Smad4相互结合，引起Smad4 泛素化降解，Smad4 的缺失导致CCL15 和CCR1 的表达升高，激活MMP9的活性，最终促进CRC 的增殖和转移。此外，Smad4 缺失还可通过CXCL1/8－CXCR2 轴募集肿瘤相关中性粒细胞，而中性粒细胞分泌相关炎性因子促进CRC 进展[14]。因此，阻断这些相关通路可能是针对Smad4 阴性的CRC 的新治疗方法。在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）背景下发生的CRC 被称为结肠炎相关性CRC，其发病机制尚不十分明确。Means 等[15]通过RNA 测序比较Smad4 表达和Smad4 缺乏的小鼠结肠上皮细胞，发现Smad4 缺乏的小鼠结肠上皮细胞许多炎症相关基因上调，包括趋化因子CCL20，并增加对结肠炎相关癌症的易感性。Hanna 等[16]进一步证实，Smad4 可以通过抑制CCL20 / CCR6 介导的炎症来抑制结肠炎症相关肿瘤。这些实验和观察结果表明，CRC 中的Smad4 缺失导致癌细胞表型和肿瘤微环境切换到更具侵袭性的癌症表型。

4 Smad4/DPC4 与CRC 的发生和发展

CRC 的发生和发展主要有染色体不稳定性（CIN）和微卫星不稳定性（MSI）两条途径，前者主要涉及APC、TP53 及Smad4 等基因。最近的一项荟萃分析系统性回顾了1999—2020 年几项关于散发性CRC 的研究，提示Smad4 基因的突变率为5.0%～24.2%[17]。Smad4 是重要的肿瘤抑癌基因，当Smad4 突变或缺失时，TGF-β 信号通路不能激活，失去对肿瘤的抑制作用。Yoo 等[18]运用免疫组化法检测1 281 例Ⅰ～Ⅳ期CRC 患者的Smad4 表达，发现210 例（占16.4%）缺失，942 例（占73.5%）为低表达，129 例（占10.1%）为高表达；结果证实，Smad4 缺失具有更差的5 年无进展生存率和7 年肿瘤特异性生存率，Smad4 缺失可作为判断CRC 预后的独立因素。为了进一步阐明Smad4 与CRC 预后的关系，Fang 等[17]回顾性分析了5 项关于Smad4 基因状态与CRC 预后关系的研究，结果表明，Smad4 突变型CRC 具有更差的预后，证实Smad4 突变与CRC 预后不良有关。上述研究提示，Smad4 缺失或突变是CRC患者预后不良的独立危险因素。

Smad4 在CRC 中缺失的主要原因是18 号染色体杂合性缺失，但是其他转录和翻译后机制也可能导致其缺失或功能障碍，如泛素化、类泛素化和microRNA 干扰。microRNA 在肿瘤抑制和肿瘤发生、发展中控制关键癌基因和肿瘤抑制基因的表达，已被证明在癌症中起着关键作用。据报道[19]，miR-20a-5p、miR-224、miR-34a、miR-19b-3p、miR-4260、miR-27a、miR-130a/301a/454等可以通过靶向Smad4 调控CRC 的发生和发展。例如，miR-144 可通过靶向下调Smad4 表达抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，Smad4 被认为是miR-144 在结肠癌进展中的下游靶标[20]。因此，研究miRNA/Smad4 通路可为结肠癌患者提供新的治疗方法，同时也为治疗Smad4 缺失的CRC 患者提供了新思路。章帅等[21]研究linc-PINT在CRC 中的作用及其机制，发现linc-PINT 与Smad4在结肠癌组织中的表达水平呈正相关，过表达linc-PINT 后，Smad4 蛋白的表达水平升高。提示linc-PINT 可通过靶向Smad4 介导CRC 的恶性进展，说明linc-PINT 是治疗CRC 的潜在靶点。LINC00941 是一种新型lncRNA，其在CRC 中表达上调，通过激活癌细胞EMT，促进CRC 细胞迁移和侵袭。研究发现[22]，LINC00941 可通过与TrCP-β 竞争性结合Smad4 蛋白MH2结构域，抑制Smad4蛋白泛素化，激活TGF-β/Smad2/3 信号通路，促进CRC 转移。Smad4 与microRNA 或lncRNA 的相互作用为转移性CRC 的机制提供了新的见解，同时也为晚期CRC 提供了新的潜在治疗靶点。

在过去20 年里，越来越多的研究[7]证实Smad4 参与Wnt/β-catenin、PI3K/AKT 和MAPK等多种经典通路的调控，形成一个复杂的网络体系，影响CRC 的发生发展。例如，Smad4 与Wnt通路的相互作用可以使肠上皮分化细胞获得干细胞样特性[23]。Smad4 缺失促进上皮细胞βcatenin 蛋白表达，导致肠上皮中的Wnt 通路激活，触发干细胞特性的获得，最终引起小鼠模型驱动分化的肠上皮细胞中的去分化和腺瘤快速形成。此外，Park 等[24]建立自发性结肠癌小鼠模型，发现Smad4 和TP53 缺失下调p21 并激活Wnt/β-catenin 通路，协同促进肠道肿瘤发生。而且Wnt/β-catenin 通路抑制剂可以抑制Smad4 和TP53 突变激活Wnt/β-catenin 通路的胃肠道癌症。Demagny 等[25]报道Smad4 的活性和稳定性由3 条主要的信号通路通过其连接区进行调节，该连接区包含一个生长因子调节的转录激活域，整合Wnt 通路、成纤维生长因子通路（FGF）和TGFβ信号通路。在Smad4 水平上整合了对生长发育和肿瘤进展至关重要的3 条主要信号通路。

根据“腺瘤—癌序贯模型”，CRC 中的致癌转化由APC、KRAS、Smad4 和TP53 的突变驱动[26]。因此，推测Smad4 与其他基因共存突变时可能对CRC 患者的预后产生累加效应。Wang 等[27]通过二代基因测序（next-generation sequencing，NGS）检测433 例转移性CRC 患者RAS、BRAFV600E、APC、TP53 和Smad4 的基因状态，发现单独的Smad4 突变不足以预测CRC 患者的预后，而这与先前研究的结论相矛盾，认为先前的研究没有评估共存突变对Smad4 突变人群的影响。进一步研究发现，TP53 和Smad4 突变的共存与转移性CRC 患者的预后明显较差有关。Chung 等[28]探讨Smad4 和PTEN 在预测结直肠腺癌患者预后方面的性能，发现与单独缺失Smad4 或PTEN 相比，同时缺失Smad4 和PTEN 可能导致CRC 更具侵袭性和不良预后。Tong 等[29]研究Smad4 在BRAFV600E 锯齿状肿瘤的作用，发现在BRAF-V600E致癌性小鼠模型中，Smad4 缺失可促进锯齿状肿瘤的快速发展，提示Smad4 是早期锯齿状癌症的关键因素，深入研究Smad4 与BRAF-V600E 关系有助于增加对这种罕见但侵袭性强的CRC 亚群的了解。杨文超[30]研究Smad4 在CRC 干性中的调控机制，构建Smad4 过表达和敲减结肠癌细胞模型，发现Smad4 过表达后，抑制了结肠癌细胞的增殖、克隆形成和微球体形成能力；Smad4敲减后，增强了结肠癌细胞的增殖、克隆形成和微球体形成能力。同时，运用高通量测序检测发现，Smad4 可促进结肠癌细胞中分化抑制因子-3（ID3）的表达，进一步构建ID3 基因敲减的结肠癌细胞模型，发现敲减ID3 增强了结肠癌细胞的增殖、克隆形成和微球体形成能力。结果提示，Smad4 可能通过调节ID3 基因的表达来抑制结肠癌细胞的干性。

5 Smad4/DPC4 与CRC 肝转移

CRC 发生远处转移的概率极高，最易转移至肝脏，这也是CRC 患者死亡的主要原因。Smad4功能丧失可以促进CRC 肝转移（colorectal cancer liver metastasis，CLM），是CLM 的独立危险因素，可作为预测CLM 的生物学指标[31]。Smad4 促进CLM 的机制研究：在Smad4 缺失的肠道肿瘤小鼠模型中发现趋化因子CCL9 表达上调，招募具有相应CCR1 受体的未成熟髓系细胞[32]，运用该小鼠模型进一步研究发现，CCR1（+）骨髓来源的细胞募集到结肠癌细胞的微环境中，产生金属蛋白酶MMP9 和MMP2，促进CLM[33]。在人类CRC细胞中，同样观察到CRC 细胞中Smad4 缺失促进趋化因子CCL15（小鼠CCL9 的人类同源物）的上调，招募CCR1（+）MDSCs，从而促进CLM 的发生[12，34]。据报道，大约50%的CRC 患者会发生CLM，而超过一半的CLM 患者在肝切除术后2 年内复发[35]。Mizuno 等[36]回顾性分析Smad4 基因状态与CLM 患者肝切除术后结局，发现在因CLM 而接受肝切除术的患者中，Smad4 突变型患者的总生存率（overall survival，OS）较差。最新研究[37]评估Smad4 突变对CLM 患者手术切缘宽度和局部复发的影响，结果表明，Smad4 突变与CLM 的手术切缘宽度或局部复发的发生率不相关，同时再次证实Smad4 突变是肝转移切除术后OS 不良的独立危险因素。上述研究强调了Smad4 基因状态在CLM 患者手术决策中的作用，但是Smad4 突变导致CLM 的分子机制尚需进一步研究。

6 Smad4/DPC4 与CRC 血管生成

无论是原发肿瘤还是继发肿瘤，一旦肿瘤直径超过1～2 mm，就会出现血管生成，因此，需要丰富的血液供应来为肿瘤的生长和转移提供营养和氧气。Li 等[38]研究Smad4 对结肠癌细胞分泌血管内皮生长因子A（VEGF-A）和VEGF-C 的作用，发现Smad4、VEGF-A、VEGF-C 是结肠癌的独立预后危险因素，Smad4 的表达与VEGFA、VEGF-C 呈负相关，过表达Smad4 抑制VEGF-A 和VEGF-C 的表达，阐明Smad4 可通过增强Smad3 磷酸化抑制结肠癌组织中VEGF-A和VEGF-C 的表达，从而抑制肿瘤血管和淋巴管生成。Smad4 功能丧失上调VEGF 的表达，促进CRC 的血管生成，有利于癌细胞侵袭血管内皮细胞，为肿瘤进展和转移提供微环境。最新研究提示，重组人妊娠特异性糖蛋白9（PSG9）在CRC患者血清中显著升高，PSG9 和Smad4形成复合物，增强Smad4 核保留，PSG9/Smad4复合物与启动子结合激活包括VEGF-A 在内的多种血管生成细胞因子的转录，促进肿瘤血管生成[39]。Smad4结合多种血管生成细胞因子的启动子促进肿瘤血管生成，与Smad4 抑制肿瘤血管生成的结论不一致。而Craven 等[40]发现Smad4 在癌细胞中的表达与微血管密度（MVD）呈正相关。VEGF 的启动子包含Smad 结合序列，深入研究Smad4 调控VEGF 表达的机制，可为CRC 抗-VEGF 的靶向治疗提供理论依据。

7 Smad4/DPC4 与CRC 淋巴管生成

肿瘤淋巴管生成是肿瘤淋巴结转移的分子生物机制，淋巴结转移是CRC 转移扩散的重要通道，也是患者的主要死亡原因之一。Smad4 可以通过调控VEGF-C 和VEGF-D 表达，影响CRC 淋巴管生成。Liu 等[41]构建Smad4 过表达细胞模型，运用Western blot 和ELISA 技术检测Smad4 和VEGF-C 的表达，发现过表达Smad4 可以抑制VEGF-C 的表达，从而抑制CRC 淋巴管生成。同时，构建Smad4 过表达裸鼠模型，在体内进一步验证过表达Smad4 抑制VEGF-C 的表达和CRC 的淋巴管生成。这项研究表明，Smad4 可能通过抑制VEGF-C 的分泌而减少结肠癌细胞的淋巴管生成，并通过抑制肿瘤的迁移、侵袭和发生发挥肿瘤抑制作用，但是目前缺乏对Smad4调控结肠癌VEGF-C 机制的研究。Li 等[42]进一步研究Smad4 调控结肠癌VEGF-C 的机制，发现与非转移性结肠癌组织相比，Smad4蛋白在转移性癌症组织中的表达增加，同时伴随VEGF-C 蛋白的表达明显增加，表明Smad4 表达与VEGF-C呈正相关。该研究结果提示，Smad4 和VEGF-C之间存在两种相反作用途径，即Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 和Smad4/VEGF-C，分别是负调控和正调控方式。进一步深入研究证实，在非转移性结肠癌中，Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 负调控VEGF-C 表达起主导作用，在转移性结肠癌中，Smad4/VEGF-C 正向调控VEGF-C 表达起主导作用，而ASLNC07322 在Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 和Smad4/VEGF-C 转换之间起到关键转换作用。综上所述，Smad4 可能通过抑制VEGF-C 和VEGF-D 的表达而减少CRC 淋巴管生成，但需关注Smad4 在非转移性和转移性CRC中的差异作用。

8 Smad4/DPC4 与CRC 神经浸润（PNI）

PNI 是指肿瘤细胞侵犯神经内膜、束膜和外膜任何一层或者肿瘤细胞在神经周围并包绕神经外膜33%以上。脉管浸润和PNI 是影响CRC局部复发及远处转移的重要因素之一。Smad4 可以通过调控淋巴管及血管生成，影响CRC 的脉管浸润，但是国内外关于Smad4 与肿瘤神经新生及PNI 的研究很少。Yoo 等[18]对Smad4 表达与CRC 患者的临床病理关系研究发现，随着Smad4表达的减少，CRC 患者发生PNI 越来越频繁；同样，Ioannou 等[9]应用HIC 检测CRC 患者，发现Smad4 表达与PNI 虽然没有显著关系，但是可以识别出一个趋势。关于Smad4 是否影响肿瘤神经新生和PNI 及其可能的机制有待进一步研究。

9 Smad4/DPC4 与CRC 治疗

目前用于CRC 化疗的药物主要有5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）和伊立替康[43]。5-FU 是一种细胞周期特异性抗代谢药物，对以5-FU 为基础的化疗耐药是治疗CRC 的一个重大障碍。CRC 中，Smad4 突变或缺失是化疗耐药的关键因素，需深入研究Smad4 调控CRC药物敏感性的机制。Zhang 等[44]探索Smad4 调控5-FU 耐药性机制，发现Smad4 通过抑制PI3K/AKT/CDC2/凋亡抑制蛋白级联反应阻滞G1 或G2 细胞周期诱导CRC 细胞的化疗敏感性。同时研究指出，MEK/ERK 通路是5-FU 诱导CRC 细胞凋亡的必需通路，但对Smad4 诱导的化疗敏感性没有影响。Wang 等[45]建立Smad4 突变小鼠模型，发现TGF-β 信号传导受损导致肠道微生物组改变，损害CRC 对5－FU 的反应。Smad4 可能是CRC 患者以5-FU 为基础化疗的预测性生物标记物。Smad4 表达水平还可作为评估OXA 联合5-FU 化疗方案治疗转移性CRC 患者预后的一个指标。miR-34a 和miR-19b 通过靶向Smad4介导对OXA 治疗的耐药性，促进结肠癌增殖和进展[46-47]。伊立替康是治疗CRC 的另一种常见的化疗药物，经常单独使用或与5-FU 联合使用以对抗结肠癌，而Smad4 缺失使CRC 对伊立替康产生耐药性[48]。Wong 等[48]报道，Smad4 阴性结肠癌细胞中的RICTOR（RPTOR independent companion of MTOR complex 2）敲低增加了伊立替康的细胞毒性作用，在机制上，Smad4 与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）的RICTOR相互作用并抑制RICTOR，从而抑制AKT 下游效应子磷酸化，AKT 的药理学抑制使Smad4 阴性结肠癌细胞在体外和体内对伊立替康敏感。因此，靶向RICTOR 可使Smad4 阴性结肠癌对伊立替康敏感。除此之外，据Mei 等[49]报道，Smad4 突变是以西妥昔单抗为基础的治疗预后不良的潜在生物标记物。这些研究表明，Smad4 在肿瘤进展和靶向治疗CRC 患者中发挥关键作用，是靶向治疗CRC 的潜在生物标记物。

10 展望

Smad4/DPC4 在CRC 的发生发展及转移过程中起着重要作用，尤其是在EMT、肿瘤炎症微环境、肿瘤转移和癌细胞干性的分子机制上的深入研究，表明Smad4/DPC4 是预测CRC 预后的潜在生物学标记物。随着基因检测技术的发展，需对Smad4/DPC4 与CRC 相关突变基因APC、TP53、KRAS、BRAF、PI3K 及MSI 等的关系进一步研究，因为Smad4/DPC4 与共存基因突变在CRC 预后和治疗方案决策上发挥着关键作用。目前尚缺乏针对Smad4/DPC4 突变CRC 的个体化和精准化治疗，分子生物学的进展阐明Smad4/DPC4 与多种信号通路相互串联，越来越多的Smad4/DPC4 相关肿瘤成分及耐药机制被发现，深入研究Smad4/DPC4 及相关生物分子将有助于对CRC 的治疗。