消化系统肿瘤m6A 甲基化修饰对非编码RNA 调控的研究进展

李晓文， 吴巍芸

（广东医科大学附属医院消化内科，湛江 524001）

表观遗传学是遗传学的一个分支，指在DNA序列不发生变化的情况下，基因功能出现稳定可遗传的变异，如DNA 甲基化、RNA 修饰、组蛋白修饰、染色质重塑、基因沉默等[1]。RNA 的化学修饰普遍存在于各种生物中。截至目前，已经发现了160 多种RNA 修饰方式，包括N6-甲基腺嘌呤（m6A）、7-甲基鸟嘌呤（m7G）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、N1-甲基腺苷（m1A）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）等，这些修饰方式丰富了RNA 功能和遗传信息的多样性[2]。其中，m6A 甲基化修饰是最常见的一种修饰方式。随着近年m6A 特异性抗体的免疫沉淀结合高通量测序（MeRIP-seq）技术的面世与成熟，对m6A 甲基化修饰的研究更为广泛和深入。研究[3-7]发现，m6A 甲基化修饰几乎参与RNA 代谢的每个阶段，包括转录、出核、剪接、降解和翻译，从而影响基因的表达，并广泛参与大脑皮质发育、心肌肥大、肥胖、炎症、肿瘤发生和发展等生理、病理过程，是学术界的研究热点之一。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一类不编码蛋白的RNA，主要包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、环状RNA（circular RNAs，circRNAs）、转运RNA（transfer RNAs，tRNAs）等，通过与其他DNA、RNA 或蛋白质相互作用，参与表观遗传调控、染色质重塑、蛋白质修饰和RNA 降解等过程[8]。在肿瘤的发生和发展过程中，多种ncRNA与癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、耐药等生物学特性密切相关，有望作为肿瘤诊断、预后的标记物或者治疗的靶点，具有广阔的应用前景[9]。

1 m6A 甲基化修饰简述

m6A 甲基化修饰是动态、可逆的，其生物学过程由甲基转移酶、去甲基化酶和m6A 结合蛋白共同介导。m6A 甲基化修饰位点主要分布在mRNA 前体和终止密码子、3’非翻译区（3’untranslatated region，3’UTR）和成熟mRNA 的内部长外显子中[10-11]。但随着研究的深入，目前发现除了mRNA，在lncRNAs、miRNAs、circRNAs 等ncRNAs 中也广泛存在m6A 甲基化修饰[12]。研究[5]发现，m6A 相关蛋白的异常表达可通过调控ncRNAs 的表达水平，进而影响肿瘤的多种生物学行为。深入研究m6A 甲基化修饰对ncRNAs 的表达调控，进一步丰富肿瘤发生的分子机制，有助于寻找肿瘤诊断及治疗的新靶标。本研究就消化系统肿瘤中m6A 甲基化修饰对ncRNAs 表达调控的研究进展进行综述，为消化系统肿瘤的诊断及治疗提供新的研究思路。

1.1 甲基转移酶

m6A 甲基化修饰由甲基转移酶催化完成。甲基转移酶也称为writers，由甲基转移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）和甲基转移酶14（methyltransferase like 14，METTL14）组成的异二聚体是主要的催化亚基，还有多个辅助亚基，包括Wilms’肿瘤相关蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP）、RNA 结合模体蛋白15/15B（RNA binding motif protein15/15B，RBM15/15B）、锌指结构域包含蛋白13（zinc finger CCCH-type containing 13，ZC3H13）等，这些亚基形成复合物发挥催化作用[13]。METTL3 具有一个S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）结合区域，能够识别特定潜在的m6A 修饰位点并将SAM 的甲基转移至相应位点；而METTL14 与METTL3 形成稳定的异二聚体，能增强METTL3 对m6A 位点的识别；WTAP无甲基转移酶活性，但可以通过与METTL3/METTL14 二聚体结合，使其活化并快速识别和结合m6A 位点[14]。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶也称为erasers，包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶alkB 同源蛋白5（α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）和脂肪与肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated，FTO）[13]。ALKBH5 可直接去除m6A 甲基化腺苷中的甲基，而FTO 则通过氧化m6A，依次生成2 个中间产物6-羟甲基腺苷和6-甲酰腺苷后才成功使m6A 去甲基化[15]。去甲基化酶的存在证实了m6A 甲基化修饰的可逆性。

1.3 m6A 结合蛋白

m6A 结合蛋白也称为readers，主要包括YTH 结构域蛋白1/2/3（YTH domain family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3）、YTH 结构域包含蛋白1/2（YTH domain containing protein1/2，YTHDC1/2）、胰岛素样生长因子2 信使核糖核酸结合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1/2/3，IGF2BP1/2/3）、不均一性核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1）等，可通过特异性识别和结合m6A 甲基化区域，参与调控RNA 结构和表达[16]。

2 m6A 甲基化修饰对ncRNA 的调控机制

2.1 m6A 甲基化修饰对miRNAs 的调控

miRNAs 是一类长度为21～25 个核苷酸的ncRNA，通过与Ago 蛋白等形成RNA 诱导沉默复合物，并与miRNA 靶基因的3’-UTR 结合，导致miRNA 降解或翻译受到抑制，从而调控基因表达[17]。miRNA 的合成经历3 个步骤：首先在细胞核中，编码miRNA 的基因转录成pri-miRNA；其次，在微处理蛋白DGCR8 和Ⅲ型核糖核酸酶Drosha 的作用下，pri-miRNA 加工为pre-miRNA；最后，pre-miRNA 出核到细胞质，被RNA 酶Dicer 进一步切割为成熟的miRNA[18]。

m6A 甲基化修饰可通过增强DGCR8 对primiRNA 的特异性识别，促进pri-miRNA 的加工和成熟。研究[7]发现，METTL3 在膀胱癌中表达上调，高表达METTL3 的膀胱癌患者预后更差，生存时间更短；进一步细胞实验证实，过表达METTL3 可上调pri-miR-221/222 的m6A 甲基化水平，增强DGCR8 对pri-miR-221/222 的识别和结合，促进pri-miR-221/222 的加工和成熟，miR-221/222 表达上调，通过与抑癌基因PTEN 的3’-UTR 结合，抑制PTEN 的表达，促进膀胱癌的发生和发展。

2.2 m6A 甲基化修饰对lncRNAs 的调控

lncRNAs 是一类长度＞200 个核苷酸的ncRNA，通过参与染色质修饰和重塑、组蛋白修饰、核小体定位改变等过程，在表观遗传学、转录和转录后水平调控基因的表达[19]。lncRNAs 由蛋白编码基因的反义链、长链基因间非编码基因、蛋白编码基因内含子、蛋白编码基因启动子区等在细胞核中经RNA 聚合酶Ⅱ或RNA 聚合酶Ⅲ催化转录而来，并在碱基配对或核糖骨架的相互作用下形成螺旋、发夹环等更高阶、更稳定的构型[20]。

m6A 甲基化修饰可以改变lncRNAs 的局部结构，促进其与RNA 结合蛋白HNRNPC 的结合或者调节lncRNAs 的稳定性，参与生物学过程[21]。lncRNA MALAT1 在多种肿瘤中均表达上调[22]。研究[23-24]发现，m6A 甲基化修饰可影响MALAT1在核中的定位和活性，并通过改变RNA 结构，调控其与相关蛋白的结合；m6A 甲基化修饰发生在MALAT1 的“发夹”结构区域并使该区域U-A 碱基配对效应减弱，MALAT1 “发夹”结构稳定性下降，促使其与RNA 结合蛋白HNRNPC 结合并推动细胞G2/M 期HNRNPC 出核转运过程，进而增强有丝分裂过程中中心体成熟和双极有丝分裂纺锤体形成所必需的蛋白激酶P58 的翻译，促进细胞有丝分裂，从而调节细胞周期的进程。在卵巢癌中，lncRNA RHPN1-AS1 的m6A 甲基化修饰水平升高，使其RNA 稳定性增强，RHPN1-AS1表达上调，通过作为竞争性内源RNA（ceRNA）竞争性抑制miR-596，使后者的靶基因LETM1 表达上调，激活FAK/PI3K/AKT 信号通路，从而促进癌细胞的增殖和转移[25]。

2.3 m6A 甲基化修饰对circRNAs 的调控

circRNAs 是一类无5’帽或3’聚（A）尾并且形成共价闭合环状结构的环状RNA，由外显子和内含子序列的非规则剪接形成；它不受核酸外切酶影响，表达稳定且难降解[26]。m6A 甲基化修饰可调节circRNAs 表达，或者改变circRNAs 的空间结构，影响其与目的基因结合。研究[27]发现，在动脉粥样硬化患者的巨噬细胞中，干扰素调节因子IFN-1 刺激后，METTL3 表达增高，circ_0029589 的m6A 甲基化修饰水平升高、表达下调，使其靶基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-1）活性增加，IL-1β、IL-18、IL-6、IL-33 等炎性因子释放增多，促进巨噬细胞的焦亡和炎症。研究[28]表明，外泌体circ_0008542 的m6A 甲基化修饰位点的存在是调控破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化和骨吸收功能的关键，m6A功能位点的突变直接导致其上述生物学效应的丧失；敲低METTL3 或过表达ALKBH5 可通过减少特定m6A 位点的甲基化，抑制circ_0008542空间结构改变，减弱其与miR-185-5p 的竞争性结合，导致miR-185-5p 的靶基因肿瘤坏死因子受体超家族成员11A（TNFRSF11A）表达减少，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收。

综上所述，m6A 相关调控因子可以通过促进pri-miRNA 的加工和成熟，影响lncRNAs 与蛋白的结合或者空间结构的稳定性及稳定circRNAs，调控靶基因的表达，进而调控肿瘤细胞的生物学行为。但目前发现，m6A 甲基化修饰的靶基因可以是促癌基因也可以是抑癌基因，甚至同一个m6A 调控因子在不同肿瘤中发挥的作用也不尽相同。因此，深入探究m6A 甲基化修饰如何调控ncRNAs 的表达和功能以及这些过程与肿瘤之间的关系，有助于寻找肿瘤潜在的发病机制，为肿瘤的诊断及治疗提供新的研究方向。

3 消化系统肿瘤m6A 甲基化对ncRNA 的调控

3.1 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）

HCC 是肝脏原发性恶性肿瘤中最常见的亚型，居全球癌症相关死亡率的第3 位[29]。研究[30]发现，在HCC 中，总m6A 甲基化修饰水平和METTL14 表达较正常组织显著下调；METTL14 低表达与患者生存期短、肿瘤低分化及微血管浸润等相关；miR-126 在多种肿瘤中发挥着抑制癌细胞转移的作用，过表达METTL14 使肝癌细胞primiR-126 的m6A 修饰水平升高，促使DGCR8 与pri-miR-126 相结合，促进pri-miR-126 加工和成熟，miR-126 表达上调，从而抑制癌细胞的侵袭和转移。在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关性HCC 的研究中，与HBV 阴性的HCC组织相比，circ-ARL3 在HBV 阳性的HCC 组织中表达显著上调，并与HBsAg 阳性、肿瘤体积较大、临床分期较晚相关；进一步的机制研究发现，HBV x 蛋白（HBV x protein，HBx）可上调METTL3 的表达，提高circ-ARL3 的m6A 甲基化水平，增强YTHDC1 对circ-ARL3 的m6A 位点的识别，促进circ-ARL3 的反向剪接和成熟，circ-ARL3 表达上调；circ-ARL3 可通过与miR-1305竞争性结合，使miR-1305 表达下调，其靶基因，如癌基因 WNT2、UBE2T、MDM2、TGF -β2 和POLR3G 等表达增加，进而促进HBV 相关性HCC 的发生发展[31]。此外，研究[32]发现，在HCC组织中METTL3 与lncRNA LINC00958 的表达均显著上调，METTL3 高表达与HCC 组织的微血管浸润、肿瘤低分化、TNM 分期较晚相关；METTL3可通过升高肝癌细胞LINC00958 的m6A 甲基化水平，增强其RNA 稳定性，使LINC00958 表达上调，通过与miR-3619-5p 竞争性结合抑制其表达，使miR-3619-5p 的靶基因肝癌衍生生长因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）表达增加，从而促进癌细胞增殖、迁移和侵袭。以上研究表明，m6A 甲基化修饰通过调控ncRNAs 参与肝癌的恶性过程。但可能由于调控的靶基因不同导致作用机制不同，使同为甲基转移酶的METTL3与METTL14 在HCC 中发挥不同的作用，这也表明，m6A 与肝癌发病机制之间的关系仍需要进一步探索。

3.2 胃癌（gastric cancer，GC）

研究[33]发现，在GC 组织中METTL3 表达显著高于癌旁组织，并与整体RNA 的m6A 甲基化水平呈正相关，METTL3 的高表达与GC 的临床分期较晚、淋巴结转移和血管浸润显著相关；过表达METTL3 可提高pri-miR-17-92 的m6A 甲基化修饰水平，增强DGCR8 对pri-miR-17-92 的特异性识别和结合，从而上调miR-17-92 的表达，后者通过抑制抑癌基因PTEN 和TMEM127的表达，激活AKT/mTOR 信号通路，进而促进GC 细胞的增殖和转移；mTOR 抑制剂依维莫司能通过抑制AKT/mTOR 通路，逆转高表达METTL3 诱导的细胞增殖；在使用依维莫司处理不同METTL3 表达水平的细胞后发现，METTL3 高表达组对依维莫司的敏感性显著高于METTL3 低表达组，提示METTL3 水平可能是一个潜在的预测依维莫司治疗GC 疗效的指标。m6A 调控ncRNAs 的过程在GC 的增殖、转移等生物学行为中发挥着重要作用。探讨m6A、ncRNAs 与GC之间的关系，寻找GC 潜在的发病机制，有助于优化GC 现有的治疗方案。

3.3 胰腺癌（pancreatic cancer，PCA）

在PCA 中，lncRNA KCNK15-AS1 的表达较正常组织显著下调，敲低KCNK15-AS1 可促进PCA 细胞迁移和侵袭；去甲基化酶ALKBH5 可降低lncRNA KCNK15-AS1 的m6A 甲基化水平，使KCNK15-AS1 表达上调，抑制上皮—间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），进而抑制癌细胞的迁移与侵袭[34]。一项与吸烟相关的PCA 研究发现，吸烟产生的卷烟烟气冷凝物（cigarette smoke condensate，CSC）通过增加转录因子NFIC 在METTL3 调控区的富集，增强METTL3 启动子的转录活性，上调METTL3 的表达；高表达的METTL3 通过提高pri-miR-25 的m6A 甲基化水平，增强DGCR8 与pri-miR-25 的结合，促进pri-miR-25 的加工和成熟，使miR-25-3p 表达上调，进而抑制抑癌因子PHLPP2 的表达，激活AKT-p70S6K 致癌信号通路，促进PCA 细胞的增殖、迁移和侵袭[35]。因此，多种m6A与ncRNAs 介导的通路的关键节点可能作为PCA 诊断和治疗的靶标，为PCA 诊断和治疗提出新的方法。

3.4 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）

研究[36]发现，YTHDF3 在CRC 组织的表达相较正常结肠黏膜组织显著上调，高表达的YTHDF3 与总生存期较短显著相关；YTHDF3 可通过识别和结合lncRNA GAS5 上的m6A 位点，降低lncRNA GAS5 的稳定性，加速其降解，使lncRNA GAS5 表达下调；而低表达的lncRNA GAS5 可通过减少与表达转录共激活因子相关蛋白YAP 的结合，来抑制YAP 磷酸化及出核，并降低其泛素化水平，进一步抑制YAP 降解过程、增强YAP 信号通路，从而促进CRC 细胞的转移。此外，高表达的METTL3 通过增加pri-miR-1246 的m6A 甲基化水平，增强DGCR8 与primiR-1246 的特异性结合，使miR-1246 表达上调；而miR-1246 通过抑制抑癌基因SPRED2 的表达，进一步抑制Raf/MEK/ERK 通路，从而促进CRC 的转移[18]。研究[37]发现，circRNA_103783 在伴肝转移的CRC 患者肿瘤组织中表达相较腺瘤组织和正常结肠组织上调；METTL3 可增加circ－NSUN2 的m6A 甲基化水平，促进由YTHDC1 介导出核的过程，使细胞质中circNSUN2 表达上调，circNSUN2 可通过RNA 结合蛋白IGF2BP2与高迁移率族蛋白A2（the high mobility group protein A2，HMGA2） 形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 的RNA-蛋白质三元复合物，增加HMGA2 mRNA 的稳定性和表达水平，进而促进CRC的肝转移。基于m6A 与ncRNAs 的关系深入研究CRC 的发病机制，探究CRC 中m6A 甲基化修饰及其调控机制，在很大程度上有助于寻找CRC诊断和治疗疗效的标记物。

3.5 胆囊癌（gallbladder cancer，GBC）

GBC 患者血清中的脱氧胆酸（deoxycholic acid，DCA） 与正常人相比显著下调；DCA 促进METTL3 从METTL3-METTL14-WTAP 甲基化酶复合物中解离，降低pri-miR-92b 的m6A 甲基化修饰水平，DGCR8 对pri-miR-92 特异性识别减弱，pri-miR-92b 成熟进程受阻，miR-92b-3p 表达下降，使其靶基因PTEN 的表达显著升高，进而抑制PI3K/AKT 信号传导而在GBC 中发挥抑癌作用[38]。以上研究提示了m6A 与ncRNAs 在GBC 发生和发展中的重要作用，但是目前对于GBC 中m6A 调控ncRNA 的作用机制认识还不足，其是否能作为GBC 的诊断标记物及治疗靶点仍需更多的证据。

4 结语与展望

随着高通量测序技术的进步以及生物信息学分析的改进，关于消化系统肿瘤中m6A 甲基化修饰调控ncRNA 的机制及作用的认识也进一步深入，为消化系统肿瘤的诊断及治疗提供了更多可能。本文就m6A 甲基化修饰调控ncRNA 的分子机制及其在消化系统肿瘤中的作用进行了总结，并发现m6A 甲基化修饰介导的ncRNA 的异常表达，导致某些致癌基因或抑癌基因的异常激活，在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。提示m6A 甲基化修饰相关的甲基化酶、去甲基化酶及m6A 结合蛋白等，有作为肿瘤标记物、诊断、治疗靶标的潜力。但是，m6A、ncRNA 与消化系统肿瘤之间的研究尚处于探索阶段，更多m6A甲基化修饰调控ncRNA 的具体机制有待阐明，m6A 结合蛋白生物学功能需进一步研究，m6A甲基化修饰位点和方式的预测及检测验证技术也有待改进。总之，m6A、ncRNA 与消化系统恶性肿瘤的发生和发展密切相关，深入探究m6A 甲基化修饰与ncRNA 的关系在肿瘤的发生和发展中的作用，有助于为消化系统肿瘤的早期诊断及治疗提供新的思路。