蓝莓果醋最适发酵温度及抗氧化性研究

王龙宇，王宇婷，王云峰，熊思瑞，金铁岩

延边大学农学院（延吉 133002）

蓝莓（Vacciniumspp.），外表为蓝色的果实，有丰富的果浆，属杜鹃花科，越橘属植物。最开始出现在北美洲，是一种长年生长的灌木果树。蓝莓大致可分为2种：一种是野生品种，果实偏小，富含花青素，一般出现在低灌木中；另一种是人工培育品种，最高可长至240 cm高，果实较大，颗粒饱满，在食用口感方面也比野生蓝莓风味更佳，人体对于花青素的吸收率也相对较高[1]。1980年初，我国对蓝莓进行初步研究，吉林农业大学小浆果研究所率先进入蓝莓研究领域建立第一个蓝莓产业化生产基地[2-3]。蓝莓果实含有丰富的蛋白质、脂肪，以及大量的维生素A、维生素C、胡萝卜素及其他人体所必需的微量元素。蓝莓中还有熊果素、花色素、超氧歧化酶、黄酮类、多酚类等多种特殊的活性成分。所以蓝莓能够缓解视力疲劳及提高夜间视力；使人体免疫力得到有效提高，预防心血管疾病，也能延缓人体衰老、增强记忆；有效地防止由胶原和花生烯酸等引起的血小板凝固，以达到预防血栓的目的；可抑制加速癌细胞增殖的酶的活性；蓝莓果实中熊果素主要功能就是通过抑制体内酪氨酸酶的活性，防止黑色素的生成，从而达到美白皮肤的作用[4]。

果醋是一种利用微生物在厌氧条件下经过酒精发酵、醋酸发酵而成的一种具有独特风味的特殊调味食品。果醋饮料中的糖类在发酵时被微生物分解为有机酸，果醋产品中仅有少量的糖类没有被转化，同时各种维生素、矿物质、氨基酸等营养成分的营养物质损失也很小，最终保存在果醋的成品中，具有一定的经济价值和食用价值[5]。

现代果醋的发酵方式主要有2种[6]：一是自然发酵，该方法操作简单，但是发酵速率不易控制，原料容易腐败且发酵周期时间相对较长；二是人工发酵，尽管该步骤操作琐碎，但发酵时间短、容易控制且产品的产率高。国内工厂使用的是人工控制方法形成的系统的工艺生产线。

蓝莓果醋（blueberry vinegar）是在果酒发酵完毕之后利用醋酸菌再次进行醋酸发酵；醋酸菌在进行代谢时能产生更多的有机酸，所含有的各种水解酶可以将蓝莓中的蛋白质水解成各种氨基酸。这些氨基酸使成品的蓝莓醋可以满足对人体必需氨基酸的提供，大幅提高蓝莓营养价值的利用率[7]。醋酸菌在进行发酵时除需要一定浓度的酒精作为底物外，还需要大量的其他营养物质，而蓝莓中丰富的营养物质非常适合发酵制作果醋类饮品[8-9]。蓝莓果醋是将蓝莓的营养特性和果醋的营养特性融为一体的一种特殊的饮料，可称作为一种功能性的饮料。经研究发现果醋中的多酚类物质通过其抗氧化作用对预防一些慢性疾病有很好的效果[10]。为此此次试验不仅表明了蓝莓果醋的最适酒精发酵温度与醋酸发酵温度，还对其进行了抗氧化性研究。

1 材料与仪器

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

栽培蓝莓（天赐四号，购于延吉市西市场）；酵母菌种（Fermivin，Bio-Ingredients Specialist公司）；醋酸菌种（上海迪发酿造生物制品有限公司）；白糖（市售）；蓝莓醋（陈酿10 d）；苹果醋、食醋（食品级，市售）。

硫代硫酸钠（AR级）、二次蒸馏水、氢氧化钠、硫酸亚铁、三氯乙酸、无水乙醇（AR级），均为天津市科密欧试剂有限公司；水杨酸、铁氰化钾、邻苯三酚、浓盐酸（上海市麦克林生化科技有限公司）；过氧化氢（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；三氯化铁（AR级，sigma公司）；DPPH、三羟基甲基氨基甲烷（均为AR级，Aladdin试剂公司）

1.1.2 主要仪器与设备

电子称（AWH-SA型，上海英展机电企业有限公司）；分析天平（FA1104型，上海精科天平有限公司）；恒温水浴锅（HH-6型，常州华普教学仪器有限公司）；半导体电子酒柜（JC-16C型，上海邦希电器有限公司）；数显恒温磁力搅拌器（HJ-3型，常州金坛市新航仪器厂）；酒精计（0.5%，3支装，沈阳玻璃仪器制造厂）；pH酸度计（PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司）；紫外分光光度计（U-3900型，上海日立高科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 预处理

在蓝莓中挑取出无破损，新鲜的蓝莓果实，把挑好的蓝莓破碎，搅拌到黏稠状。因为酵母菌的生长代谢环境需要消耗大量葡萄糖，并且糖的浓度不宜过高，过高的糖原会使酵母菌代谢旺盛，酒精浓度持续升高，且变化速率过快，不宜进行控制；如果糖原过低则会导致酵母菌代谢速率过慢，发酵周期延长的同时会引起副产物即杂醇的产生[11]。因此在进行酒精发酵之前要加入适量的白糖来调整蓝莓果浆中糖的浓度，将初始糖度调整至15%~16%，加入原料质量分数0.01%的硫代硫酸钠杀菌4 h。

1.2.2 最适酒精发酵温度的测定

称取原料质量0.1%的Fermivin酵母菌，加入适量蒸馏水，在30 ℃水浴恒温30 min活化酵母菌。等待出现大量泡沫，即活化充分。将活化好的酵母菌倒入之前调制好的蓝莓浆液中，待搅拌均匀后放入恒温酒柜中发酵。

在确定蓝莓果酒酒精发酵的常用酵母菌种和接种量情况下，对酒精发酵影响最大的是发酵温度，温度的高低影响酵母菌的活性，即酵母菌的代谢速率的快慢。温度过高导致酵母菌活性过快，酒精度的确定不易控制，并且温度太高酵母菌直接失活；温度过低，代谢速率慢，导致发酵周期延长。酒精发酵阶段，设置4个温度梯度，分别为10，15，20和25 ℃，在4种温度下发酵时记录每天的酒精度，根据发酵期间酒精度的变化速率确定酒精发酵时期的最适发酵温度。

一般情况下，果酒发酵结束的酒精度在15%vol，其中有的会高一些，但是最高的一般也不会超过20%vol。酒精度过高会导致渗透压过高，不适合醋酸菌进行正常的生理生化活动，因为醋酸菌的耐酒精能力很弱，适合醋酸菌发酵的酒精度约在6%vol，因此试验需控制酒精度在5%vol~6%vol时就终止酒精发酵阶段，将发酵好的果酒进行压榨、过滤，放入冰箱中。

1.2.3 最适醋酸发酵温度的测定

取上述待用的酒精度5%vol~6%vol的酒醪，在80 ℃条件下加热30 min，将其温度降至30 ℃。撒入醋酸菌粉末发酵，间隔一定的时间慢慢搅拌并通入适量氧气。待种液的总酸含量上升至2%，即活化完毕，可接种使用，用于醋酸发酵阶段。将扩大培养的醋酸菌按规定的比例加入待用的蓝莓果酒中，定期搅拌均匀，进行醋酸发酵阶段，待发酵结束后过滤，最终得到蓝莓果醋。

醋酸发酵阶段，向发酵好的蓝莓果酒中添加一定的醋酸菌种，使其分别置于25，30，35和40 ℃温度下进行醋酸发酵，每隔24 h测定发酵期间总酸含量，根据总酸含量的变化情况及发酵结束的最终含量确定醋酸发酵的最适温度。总酸含量采用标准的NaOH滴定法测定。

1.2.4 蓝莓果醋抗氧化性质的研究

试验以对DPPH、·OH-、·O2-这3种自由基的清除能力大小为指标，利用得到的最适酿造温度酿制出来的蓝莓果醋与市售苹果醋和食醋的自由基清除率对比，分析三者的抗氧化能力情况。

1.2.5 蓝莓果醋DPPH清除率（R1）

蓝莓果醋对DPPH自由基清除能力的测定参考贾冬英等[12]方法进行合理修改进行测定。蓝莓果醋DPPH清除率（R1）按式（1）计算。

式中：A0为乙醇+DPPH的吸光度；A1为样液+DPPH的吸光度；A2为样液+乙醇的吸光度。1.2.6 蓝莓果醋·OH-清除率（R2）

蓝莓果醋对羟自由基·OH-清除能力的测定采用水杨酸法并且做出合适修改进行测定[13]。蓝莓果醋·OH-清除率（R2）按式（2）计算。

在510 nm波长下，测定样品溶液的吸光度A1，蒸馏水代替H2O2测定得吸光度A2，蒸馏水进行空白调零。蒸馏水代替样液得到的吸光度记作A0。

1.2.7 蓝莓果醋·O2

-清除率（R3）蓝莓果醋对超氧阴离子自由基清除能力测定采用邻苯三酚自氧化法进行测定[14]。蓝莓果醋·O2-清除率（R3）按式（3）计算。

依据方法配制好的溶剂在299 nm波长下测定吸光度A1，蒸馏水代替邻苯三酚测定吸光度A0，蒸馏水代替果醋样液测定吸光度A2。

2 结果与分析

2.1 不同温度对酒精发酵的影响

在不同温度条件下酒精发酵时酒精度上升变化的曲线如图1所示。经过5 d发酵，15 ℃时酒精升高的速度最快，20 ℃次之，10 ℃和25 ℃条件下前3 d均无明显变化，第4天变化明显。通过参考周景瑞等[15]的研究发现，随着发酵温度的升高，酒精度呈现先上升后下降趋势。通过对比发现15 ℃时酒精升高的速率变化过快，不易控制，且最高酒精度达7%vol，但是10 ℃和25 ℃最高的酒精度数满足不了后续醋酸发酵的条件，在较短的时间内20 ℃的条件下的酒精发酵温度可达6%vol，且变化速度容易掌控，因此酒精最适发酵温度为20 ℃。

图1 不同发酵温度对酒精发酵的影响

2.2 不同温度对醋酸发酵的影响

如图2所示，不同温度条件下果醋中总酸含量均呈上升趋势。发酵开始的前2 d变化趋势不明显，第3天开始总酸含量明显升高。从曲线的变化趋势可以看出：在35 ℃条件下总酸含量上升最显著，醋酸菌的生理活性最高；25 ℃时，上升最慢，由微生物学知识可知该温度条件下醋酸菌的生理代谢缓慢，温度达到40 ℃时，出现部分醋酸菌失活，代谢速率变低。综上所述，醋酸发酵阶段的最适发酵温度为35 ℃。

图2 不同发酵温度对醋酸发酵阶段的影响

2.3 食醋、苹果醋和蓝莓果醋的自由基清除能力情况

从表1可以看出，蓝莓果醋对DPPH清除率为51.7%，对·OH-清除率为76.4%，对·O2-清除率为27.5%。苹果醋对DPPH清除率为49.4%，对·OH-清除率为71.4%，对·O2-清除率为24.4%。食醋对DPPH清除率为45.9%，对·OH-清除率为59.7%，对·O2-清除率为20.3%。结果表示，3种样品的自由基清除率之间都存在显著性差异。其中，蓝莓果醋的清除能力最好，这可能和蓝莓中含有多种还原能力较强的活性成分如多酚、花色素和黄酮类等物质有关。

3 结论

利用微生物发酵将蓝莓进行两步发酵，最终得到蓝莓果醋。试验测定蓝莓最适酒精发酵温度，并确定最适醋酸发酵温度。对蓝莓果醋的抗氧化性质进行分析，分别测定DPPH、·OH-、·O2-自由基清除能力试验，与市售苹果醋和食醋进行对比后发现蓝莓果醋的清除能力最好，说明试验方法酿制的蓝莓果醋有很好的抗氧化能力。

结果表明：蓝莓果醋的最适酒精发酵温度为20 ℃；在此条件下发酵制成的蓝莓果酒酒精度达到5%vol~6%vol时，进行压榨、过滤后终止发酵；此时的酒液呈明亮深红色，其酒精度比较容易控制，更适合进行后续的醋酸发酵。蓝莓果醋最适醋酸发酵条件为温度35 ℃，此条件下发酵酿制的蓝莓果醋外观品相最好，口感最佳；抗氧化性试验结果表明，蓝莓果醋的自由基清除率分别为51.7%（DPPH），76.4%（·OH-）和27.5%（·O2-），高于市场销售的苹果醋和食醋，说明试验方法酿制的蓝莓果醋有很好的抗氧化能力。

综上所述，利用试验优化的发酵温度可大幅改善蓝莓醋风味，所得到的果醋酸甜适中，并且该温度酿制的蓝莓果醋的抗氧化能力高于市售的苹果醋和食醋，是一种具有饮品开发价值的保健型果醋。一旦应用于工厂工艺上，不仅能减少蓝莓的浪费现象，也有助于推动蓝莓产业的发展。