神经病理性疼痛中表观遗传学作用机制研究进展

文声昕 吴 强 韩亚坤 郭珊珊 唐 奕 柯 璐 何仁亮

国际疼痛研究协会将神经病理性疼痛(neurpathic pain,NP)定义为由躯体感觉神经系统的病变或疾病引起的疼痛。其常见病因有糖尿病神经病变、脊髓损伤、病毒感染(带状疱疹后神经痛)和化疗等,常见症状为异常疼痛、痛觉过敏、自发性疼痛和感觉异常等,这些症状使患者出现睡眠障碍、焦虑,甚至抑郁。目前治疗NP包括药物干预(抗惊厥药和阿片类药物)、物理治疗和局部神经阻滞,但效果有限和不良反应增多。由于NP的发病机制尚未得到充分阐明,临床治疗效果有限,故探索NP发生的分子机制具有重要意义。在伤害性感受系统中,表观遗传修饰被认为调控分子的长期变化,在组织损伤相关疼痛的发展和维持中起着关键作用[1]。Waddington在1942年提出表观遗传这一概念,它指的是不改变DNA序列调节基因表达,并在环境刺激时对基因转录或翻译过程的调控,使个体产生长期的影响。表观遗传修饰有RNA修饰、非编码RNA、DNA甲基化和组蛋白修饰,这些修饰方式直接或间接地影响基因表达。本文将对目前NP表观遗传学作用机制研究进展进行综述,以期为该疾病的诊疗提供潜在靶点。

一、RNA修饰

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是表观遗传学中RNA甲基化的一个新兴领域,包括以METTL3、METTL14、WTAP和KIA1429为代表的写入蛋白介导甲基化过程,以FTO和ALKBH5为代表的擦除蛋白介导去甲基化过程,以及YTH和HNRNP为代表的阅读蛋白介导甲基化识别和mRNA翻译过程[2]。m6A修饰可被不同的m6A结合蛋白YTH结合,从而调节RNA的转录、剪接、输出、翻译和降解来影响各种生理和病理过程。近年来证据表明,m6A修饰调控基因可能参与了NP的发展和维持[3～6]。

在完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant, CFA)诱导的小鼠炎性疼痛模型中,METTL3介导的m6A修饰通过调节pri-miR-365-3p加工来调节疼痛敏化[2]。Pan等[3]选择性下调脊髓中METTL3,这提高了脊髓中10～11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1, TET1)mRNA和m6A的水平,从而产生疼痛超敏反应。相比之下,过表达METTL3逆转m6A的缺失,阻断CFA诱导脊髓中TET1的增加,可导致疼痛减弱;同时YTHDF2水平降低,脊髓TET1稳定上调,这揭示下调脊髓METTL3与YTHDF2协调的新机制,即稳定脊髓神经元中TET1的上调,有助于调节炎性疼痛。Zhang等[4]建立保留神经损伤(spinal nerve injury, SNI)大鼠疼痛模型,通过分析METTL3和m6A甲基化表达水平,发现与假手术大鼠比较,NP大鼠中METTL3和m6A甲基化显著下调。

进一步研究发现,METTL3通过介导pri-miR-150在基因498处的m6A甲基化,与YTHDF2结合加速了miR-150的成熟。而miR-150可直接靶向脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA,最终建立METTL3/miR-150/BDNF调控通路。结合临床带状疱疹患者血清标本,证明METTL3在带状疱疹患者中也下调。

m6A去甲基化酶FTO在周围神经损伤背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)中产生Runx1而上调,通过消除Ehmt2 mRNA、稳定Ehmt2 mRNA/G9a表达和沉默受损DRG中μ阿片受体(mu-opioid receptor, MOR)表达,引起神经损伤疼痛超敏反应。鉴于FTO抑制剂甲氯芬那酸为非甾体抗炎药,阻断FTO可能在神经性疼痛管理中具有潜在的临床应用[5]。在脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)模型中,脊髓神经元中基质金属蛋白酶24(matrix metalloproteinase24,MMP24)表达上调。甲基化RNA免疫沉淀测序和RNA免疫沉淀测定表明,m6A减少神经性疼痛条件下MMP24 mRNA的富集。此外,FTO与脊髓神经元中的MMP24共定位,并在SNL后与脊髓中MMP24 mRNA结合增加[6]。总之,在各种疼痛模型中,RNA m6A修饰介导了痛觉敏化的多种调节机制。这些研究不仅揭示了神经性疼痛背后的表观遗传学机制,而且还为治疗提供了新思路。

二、非编码RNA

人类基因组中仅2%由蛋白质编码基因组成,其余约98%是非编码基因。非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是一组不编码功能蛋白的RNA,具有调节转录、翻译和稳定性的特点。ncRNA主要包括microRNA(miRNA)、长ncRNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)和小核仁RNA(snoRNA)。许多研究发现,miRNA、lncRNA和circRNA与NP的病理过程有关[7～10]。

miRNA与靶mRNA结合或直接与蛋白质相互作用来负调控基因表达。miRNA主要通过与非翻译区(3′UTR)结合来控制基因的表达,导致mRNA降解或抑制蛋白质翻译。在NP诱发的疼痛基因中,80%受miR-183家族的调控。此外,miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-92a簇成员的过表达可引起机械性异位痛,而阻断这些miRNA可减少神经损伤引起的机械性异位痛。miR-17-92簇主要通过下调DRG中的多个KV通道来引起疼痛[7]。lncRNA linc00311在NP大鼠脊髓中表达显著上调,降低其可抑制STAT3活化而下调免疫炎性细胞因子及(Ca2+)i水平,从而降低疼痛阈值[11]。Du等[8]鉴定了一种保守的lncRNA,命名为神经损伤特异性lncRNA(NIS-lncRNA)。

DRG中ELF1是一种与NIS-lncRNA启动子结合的转录因子,能诱发NIS-lncRNA上调,从而促进受损的DRG神经元中Fus触发CCL-2基因表达,有助于神经损伤诱导的伤害性超敏反应的发展和维持。由此可见,NIS-lncRNA可能是NP的内源性引发剂,可为NP的诊疗提供潜在靶点。另外,神经损伤诱导背根神经节特异性富集的长链非编码RNA(DS-lncRNA)的下调促进了转录辅因子RALY与RNA聚合酶Ⅱ(RNP Ⅱ)和Ehmt2基因启动子的结合,增加Ehmt2 mRNA和G9a蛋白的表达,下调包括Oprm1 mRNA和MOR在内的许多疼痛相关基因,并引起神经性疼痛[9]。Zhang等[10]研究发现,与假手术组比较,SNL大鼠3、7、10、14天后脊髓中circAnks1a的表达明显上调。

SNL大鼠的疼痛行为可以通过siRNA下调circAnks1a来缓解,其机制是通过调节血管内皮生长因子B的表达以降低SNL大鼠脊髓的兴奋性来缓解NP。Cao等[12]使用患有带状疱疹后神经痛(post herpetic neuralgia, PHN)患者的皮肤来研究PHN中miRNA的表达,发现PHN患者皮肤中的miR-4506、hsa-miR-1258和hsa-miR-330-5p上调超过5倍。综上所述,ncRNA的发现为NP的诊断和治疗带来了新的前景,关于作用机制需进一步研究。

三、DNA甲基化

DNA甲基化通过多种机制抑制基因转录。甲基-cpg结合域(methylated DNA binding domain, MBD)蛋白家族作为转录抑制因子或辅助抑制因子的对接位点,在胞嘧啶的第5碳上添加一个甲基,产生5-甲基胱氨酸(5mC),这一过程由DNA甲基转移酶1 (DNA methyltransferase 1, DNMT1)、DNMT3a和DNMT3b催化,它们建立并维持了基因组甲基化模式。而5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是由TET介导,促进DNA去甲基化[13]。哺乳动物基因组中,70%～80%的CpG被甲基化,作为一种更稳定的表观遗传修饰,其可以沉默或下调启动子或增强子,这种不同的基因表达调节可影响疼痛和镇痛。

1.DNMT触发DNA甲基化沉默基因表达:周围神经损伤通过激活受损DRG感觉神经元中的转录因子CREB来上调DNMT1的表达。这种上调与Kcna2启动子和5′-非翻译区域内某些CpG位点的DNA甲基化水平升高相关,而Kv1.2是NP发生的关键因素,DNMT1可能有助于NP的发展[14]。Zhao等[15]建立SNL和慢性压迫性损伤(chronic compress injury, CCI)动物模型,证明通过激活转录因子OCT1能增加受损DRG神经元中DNMT3a的表达,阻断这种增加可阻止神经损伤引起的Kcna2表达,从而减轻NP。相反,在没有神经损伤的情况下,模拟这种增加会降低Kcna2启动子活性,降低Kv电流,增加DRG神经元的兴奋性并导致脊髓中枢敏化和神经性疼痛症状,这表明DNMT3a可能通过抑制DRG中的Kcna2表达而导致NP。

Liu等[16]进一步研究DNMT3a介导的miR-214-3p表观遗传学抑制作用,发现其增强星形胶质细胞中CSF1的产生,继而在SNL模型大鼠中诱导了神经炎症和疼痛行为。此外,DNMT3b在SNL模型中下调,引起GPR151基因启动子的去甲基化,促进转录因子Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)与G蛋白偶联受体151(G-protein coupled receptor 151,GPR151)启动子的结合,并进一步增加脊髓神经元中GPR151的表达。增加的GPR151可能通过激活MAPK信号转导和增加疼痛相关基因表达而促成NP的发生[17]。有研究表明,周围神经损伤通过DRG中DNA甲基化来下调MOR和Kv1.2的表达,从而诱发NP[13]。

2.DNA去甲基化TET1调控甲基化水平:DNA去甲基化TET1过表达通过调控MOR启动子区域甲基化水平,增加MOR的表达,从而改善神经损伤导致的痛觉过敏和吗啡耐受[18]。值得一提的是,化疗引起的神经性疼痛是癌症治疗的常见剂量限制性不良反应,但其潜在机制在很大程度上是未知的。Deng等[19]构建大鼠奥沙利铂疼痛模型,使用全基因组表达微阵列和基因本体分析确定脊髓背角中序列特异性DNA结合蛋白HOXA6上调。其通过TET1介导的SOX10启动子去甲基化导致NP。紫杉醇诱导的双孔结构域K+通道1.1 (K2p1.1)的下调是由DRG中启动子DNA甲基化增加引发NP。损伤的DRG中TET1过表达可能通过挽救K2p1.1的表达来减轻化疗引起的神经性疼痛[20]。

5-氮杂胞苷是一种目前被许可用作化疗的DNMT抑制剂,基于其降低MeCP2水平的功效,它也可用作镇痛剂。然而,镇痛效果只有在鞘内给药时才能达到,因此限制了其潜在的治疗用途。另一方面,降低DNA甲基化会导致疼痛过敏,因为受影响的CpG位点(启动子与内含子区域)将对基因表达的变化产生不同的影响[21]。综上所述,DNMT可能与基因启动子结合,导致基因甲基化或去甲基化,从而加重或缓解NP,这将为NP的治疗提供新的指导。给予基因特异性siRNA或慢病毒治疗是未来的一种前瞻性治疗选择。

四、组蛋白修饰

组蛋白修饰是对核小体N-端组蛋白尾部的转录后修饰(post-transcriptional modifification, PTM),可调控染色质的结构和功能。组蛋白乙酰化主要发生在H3和H4 N-端保守的赖氨酸残基上,由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)催化进行。这种可逆的乙酰化修饰作用可使染色质结构发生动态改变,并对基因转录产生影响[22, 23]。组蛋白甲基化是由组蛋白甲基转移酶(histonemethyl transferase, HMT)完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上,疼痛过程中不同程度的组蛋白甲基化增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性[24, 25]。

1.组蛋白乙酰化对痛觉敏化发挥重要调节机制:在紫杉醇引起的NP模型中,脊髓背角中活化T细胞的核因子(NFATc2)可直接上调CXCL14的表达,这是通过NFATc2和p300之间相互作用增加了CXCL14启动子区域中组蛋白H4的乙酰化。此外,敲除脊髓背角的CXCL14显著减弱了紫杉醇诱导的NP[22]。组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ac)可激活星形胶质细胞中降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide, CGRP),神经损伤后表达H3K9ac的星形胶质细胞数量增加。抑制CGRP可减轻NP的发展,同时抑制CCI大鼠中H3K9ac、CX3CR1和IL-1β的表达[23]。另外在SNL模型中,CXCL13被激活引起疼痛,其机制是受损DRG神经元中锌指蛋白382(ZNF382)的下调,这破坏了HDAC1和SET结构域[26]。

组蛋白乙酰化可通过溴区结构域和超末端结构域(bromodomain and extra terminal domain, BET)蛋白募集,对小胶质细胞介导的脊髓神经炎症的关键作用,结合HDAC和BET抑制剂靶向神经性疼痛可能代表一种新的治疗选择[27]。Borgonetti等[28]研究SUM52和SUM35的新型双重HDAC/BRD4抑制剂在小鼠SNI模型中的药理学特征,结果显示,作为多靶点药物的单个分子同时调节BET和HDAC活性,可为NP缓解带来希望。丙戊酸是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可通过STAT1/NF-κB和JAK2/STAT3信号通路调节小胶质细胞功能并抑制脊髓神经炎症[29]。

2.组蛋白甲基化参与了痛觉敏化的形成:zeste同源物2(EZH2)增强子对H3赖氨酸27(H3K27me3)的三甲基化是一种表观遗传标记,可调节周围神经损伤后炎症相关基因的表达[24]。精氨酸甲基转移酶1(coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1, CARM1)是组蛋白精氨酸甲基化的表观遗传调节因子,鞘内注射BC-1215(一种新型Fbxo3抑制剂)可阻止CARM1泛素化,从而阻断K+通道基因沉默并改善神经损伤后的异常性疼痛[25]。另外,G9a(由Ehmt2编码)是组蛋白3赖氨酸9甲基转移酶,负责基因沉默的关键染色质调节剂,G9a抑制剂(UNC0638)可用于增强阿片类药物在治疗慢性神经性疼痛中的镇痛作用。由此可见,组蛋白乙酰化与去乙酰化、甲基化与去甲基化通过不同的调节机制参与NP的发生,这些都将是NP治疗和预防的重要研究对象。

目前,表观遗传修饰参与NP形成的分子机制尚不明确。然而,越来越多的证据表明,RNA修饰、DNA甲基化和组蛋白修饰通过调节神经炎性反应、神经胶质细胞的激活、离子通道等在NP的发展中起到关键作用。目前的研究大都基于动物模型的探索,并且表观遗传修饰之间交叉仍然难以明确,研究人员需要在更高级动物模型中探索其他的表观遗传调控模式,可使用全基因组方法,例如染色质免疫沉淀,然后进行深度测序(ChIP-seq),以绘制在神经性疼痛的基因和非基因区域的范围。随着对NP的表观遗传修饰及其分子机制认识的不断增加,NP的有效治疗和预防前景更加广阔。