袋装酸笋中优势腐败霉菌的分离与鉴定

吴锦兰，李静怡，白 云，巩 僖，卢凯玲，崔 娜，熊建文

（1. 柳州工学院食品与化学工程学院，广西 柳州 545616；2. 柳州市螺蛳粉植物源性配料研究重点实验室，广西 柳州 545616；3. 柳州市特色食品风味与品质控制工程技术研究中心，广西柳州 545616）

酸笋是一种特色的传统性发酵食品，在我国南方地区被普遍应用于菜肴烹煮及作为各类食品的调味料。酸笋是以新鲜竹笋为原材料，通过食盐进行腌制，经过漂水排气后密封自然发酵制作而成[1-2]。发酵后的酸笋风味独特，含有丰富膳食纤维成分与多种人体所必需的氨基酸，有辅助降血脂、提高机体抵抗力等作用[3-4]。酸笋作为柳州螺蛳粉的灵魂，近年来受疫情影响，在“宅经济”形势下，袋装螺蛳粉销售量迅速增长，对于袋装酸笋的需求量也日益增加[5]。袋装酸笋原料水分含量高、营养丰富，在发酵、生产操作、贮存等过程中易受到微生物污染而腐败变质，发生胀袋、变色、软化、腐臭变质等现象。部分腐败微生物在一定适宜条件下，甚至会通过分泌产生相应的毒素，从而严重影响人类健康和生命安全[6]。在微生物污染中，霉菌污染是其中最主要、影响最大、危害也最大的污染[7-8]。目前，有关食品霉菌污染分析及控制的研究已经开展。岳晓禹等人[9]对贮藏玉米中的腐败霉菌进行了分离，得到一株优势腐败霉菌M13，进一步鉴定为米曲霉（Aspergillus oryzae），为粮食的科学贮藏和食品安全控制提供参考。姚卫蓉等人[10]对焙烤食品的腐败霉菌进行了研究，表明导致焙烤食品发霉的菌种主要是曲霉菌和青霉菌。张容鹄等人[11]对槟榔干果贮藏中优势腐败霉菌进行了分离和鉴定，得出2 种优势霉菌，分别鉴定为泡盛曲霉（Aspergillus awamori） 和灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）。谢欣等人[12]从已发霉变质的年糕中分离出优势腐败霉菌，初步鉴定为单端孢霉（Trichothecium）、青霉菌（Penicillium） 和曲霉菌（Aspergillus），并试用多种不同类型的防霉剂，结果表明脱氢醋酸钠和肉桂精油结合使用，可达到抑菌、防腐和延长年糕保质期的目的。霉菌的种类和数量能基本反映食品的安全状况，有效控制霉菌的生长、繁殖对保持食品的安全与营养非常重要。

目前，关于袋装酸笋腐败霉菌方面的研究甚少，为了预防和控制酸笋在腌制、生产和贮存中发生腐败问题，从腐败变质的袋装酸笋中分离筛选得到优势腐败霉菌，并通过形态学观察和分子生物学结合的方法对腐败霉菌进行鉴定，分析腐败霉菌的种属特性，为袋装酸笋生产工艺中筛选有效的抑菌剂及针对性的灭菌方法和优化贮藏条件等方面提供一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

袋装酸笋，市售，待其自然腐败。

1.1.2 试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA（附加抗菌素）、真菌基因组DNA 提取试剂盒等，广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

SQ810C 型自动高压蒸汽灭菌锅，上海岚荟生物科技有限公司产品；LRH-150 型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；Nikon Eclipse E200 型光学显微镜，上海衡浩仪器有限公司产品；L9800 型基因扩增仪，北京莱普特科学仪器有限公司产品；DYY-6D 型电泳仪，北京六一仪器厂产品；GenoSens 1880 型凝胶成像分析系统，上海勤翔科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 优势腐败霉菌的分离纯化

取已腐败袋装酸笋置于装有适量的无菌生理盐水的锥形瓶中摇匀后进行10 倍梯度稀释，取适当梯度的菌悬液200 μL 涂布于PDN 培养基中，于28 ℃条件下培养。待其长出霉菌后，挑取形态各异的菌株进一步分离纯化，直至得到形态不同的单菌落并编号。

1.3.2 真菌菌株的形态学观察

参考《真菌鉴定手册》[13]进行形态学观察。

1.3.3 菌种分子生物学鉴定

（1） 菌体的培养与收集。将分离活化的菌株接种到PDA 液体培养基中，在28 ℃下以转速200 r/min 振荡培养6 d，得到的菌丝培养液通过抽滤后收集菌丝。

（2） 真菌总DNA 的提取。称取50～100 mg 真菌菌丝后倒入液氨研磨成粉末，然后按照真菌基因组DNA 提取试剂盒说明书提取总DNA。

（3） PCR 扩增。以提取的霉菌DNA 为模板，进行PCR 扩增待鉴定菌株的rDNA-ITS 区域，将最后得到的PCR 扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

PCR 引物表见表1，ITS 基因PCR 反应程序见表2，ITS 基因PCR 扩增程序见表3。

表1 PCR 引物表

表2 ITS 基因PCR 反应程序/μL

表3 ITS 基因PCR 扩增程序/次

（4） rDNA-ITS 碱基序列分析。将检测合格的扩增产物送至华大基因生物有限公司进行测序，测序结果通过NCBI 网的BLAST 程序来搜索同源序列。

（5） 系统发育树分析。挑选与靶目标列相似性较高的参考序列，采用MEGA7.0 的邻接法构建系统发育树。

（6） 菌种鉴定。根据菌株的形态学特征，结合系统发育学结果，对菌株进行鉴定[14]。

2 结果与分析

2.1 腐败霉菌的分离纯化

从腐败袋装酸笋中共分离纯化出2 种主要的优势腐败霉菌，分别编号为F1、F2。在PDA 平板上28 ℃下培养7 d 后，菌株F1 菌落正面呈黄绿色，反面呈棕黑色，菌落中心有突起，质地紧密，棉絮状，生长速度较慢，在PDA 平板上28 ℃下培养7 d 后直径为15～20 mm（见图1（a） 和（b））；菌株F2 菌落正面呈灰绿色四周呈白色，反面呈灰白色，菌落中心无突起，较平坦，质地疏松，绒毛状，生长速度较快，在PDA 平板上28 ℃下培养7 d 后直径为40～50 mm（见图1（c） 和（d））。

在PDA 平板上28 ℃培养7 d 后菌落形态见表4，二种腐败霉菌的菌落形态图见图1。

表4 在PDA 平板上28 ℃培养7 d 后菌落形态

图1 二种腐败霉菌的菌落形态图

2.2 优势腐败霉菌的显微结构

菌株在显微镜下的形态见图2。

图2 菌株在显微镜下的形态

将分离得到的2 种目标菌株进行显微观察。由图2 可知，通过光学显微镜观察发现，菌株F1 的菌丝有横隔，分生孢子头呈分枝根状，分生孢子链生呈宽圆柱或广椭圆形，壁较平滑；菌株F2 的菌丝有横隔，分生孢子头呈球状，分生孢子近球形或椭圆形，壁稍光滑。

2.3 优势腐败霉菌的的分子学鉴定结果

优势霉菌的PCR 产物电泳图见图3。

通过PCR 扩增，得到优势腐败霉菌的rDNA-ITS片段。由图3 可知，霉菌F1、F2 的PCR 扩增产物均在500～750 bp 出现明显目标条带，ITS 序列分别为525 bp和555 bp，达到PCR 扩增预期结果。

图3 优势霉菌的PCR 产物电泳图

将目标菌株的rDNA-ITS 片段为模板，通过Blast 检索进行序列比对分析并构建系统发育树，结果表明，菌株F1 与枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 亲缘关系最近，达99.43%；菌株F2 与烟曲霉（Aspergillus fumigatus） 亲缘关系最近，达99.31%。结合形态学观察和分子生物学鉴定结果可知菌株F1 为枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），菌株F2 为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系统发育树见图4，基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系统发育树见图5。

图4 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系统发育树

图5 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系统发育树

3 结论

主要分离出了袋装酸笋中的腐败霉菌，通过传统的真菌形态特征和显微镜观察对分离出的菌株作了初步的鉴定，然后对纯化菌株进行PCR 扩增rDNA-ITS 序列并测序和构建系统进发育树，结合分子生物学法，最终确定了导致袋装酸笋腐败的菌株的种属。袋装酸笋中的优势腐败霉菌主要为枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。其中，烟曲霉是常见食品腐败霉菌，嗜高温，在45 ℃或更高的温度下生长茂盛，会引起食品的快速腐败变质，使营养物质大量损失[14]。袋装酸笋在工业化生产过程中，在不影响食品风味的条件下，可以从包装条件及贮存温度等方面抑制优势腐败霉菌的生长，从而达到延长产品保质期的目的，为今后防止袋装酸笋在生产加工及销售贮藏中腐败变质，选择适宜的杀菌保鲜方式提供一定参考依据。