糖尿病足溃疡创面修复相关机制的研究进展

罗富强 余电柏 谢康麒 李载永 周海东 罗昌泰 韦积华

右江民族医学院1临床学院，2研究生学院（广西百色 533000）；3右江民族医学院附属医院创伤医学中心（广西百色 533000）

近年来有最新研究［1］报道全世界有将近10 亿糖尿病患者正遭受糖尿病疾病的困扰，预计该数字将在2030年增加25%，在2045年增加51%，这患病人数大约占全球人数的8.5%，而且高达八成以上的糖尿病患者生活在中低收入国家，而且我国也是糖尿病患者最多的国家之一。如果长期严重的糖尿病不经过规范治疗和严格控制血糖往往导致糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers，DFUs）等严重并发症，包括截肢［2］。一旦出现糖尿病足溃疡，这不仅是对糖尿病患者身体的摧残，将严重降低糖尿病患者的生存质量，还增加了社会和患者家庭负担，住院医疗费用支出大幅度增加。糖尿病足溃疡已经成为全球关注的公共卫生健康问题［3］。因此，目前医疗行业急需研究治疗糖尿病足溃疡的有效方法，提高保肢率，提高糖尿病足溃疡患者的生活质量，而最新研究证明横向骨搬移技术（tibia transverse transport，TTT）可以有效治疗糖尿病足溃疡，但是其促进糖尿病足溃疡修复的机制并没有完全明确，有待进一步研究清楚。糖尿病足溃疡创面修复的机制包括很多复杂的信号通路，信号通路参与糖尿病创面的发病和进展，是糖尿病创面病理机制和治疗药物药理研究的主要靶点之一［4］。根据最新国内外文献报道［5-10］糖尿病足溃疡创面修复的有关机制包括外泌体（exosomes，Exos）、Notch、TGF-β、NF-κB、Wnt/βcatenin、MAPK、PI3K/Akt/mTOR 信号通路等，对糖尿病足溃疡创面修复有关机制进行综述，旨在为糖尿病足溃疡创面的治疗及其机制研究提供新的思路。

1 Exos 信号通路

Exos 是由多种类型细胞分泌的独特的纳米颗粒，是源自内体的细胞外囊泡的子集，其直径范围为40 ～160 nm（平均100 nm），Exos 标记物主要有CD9、CD63、CD81、Tsg101 和Alix1 等。通过阴性染色法和电镜显示，不同体液中分离出的Exos 具有高度的形态多样性，在透射电子显微镜下呈杯状，而低温电子显微镜下则呈圆形囊泡状。Exos 的发生、形成是一个严格精细化的调控过程［11］，并且广泛分布于各种体液中，目前已从血液、唾液、羊水等体液中分离提取出来，其是富含多种生物活性的物质，包括蛋白质、脂质、DNA 和RNA 等［12］，其中备受关注的miRNA-21-5p［13］是一种新的生物标志物，是一种新的机制，Exos 可促进糖尿病足的缺血性组织修复和血管新生。Exos 有独特的N-糖基化和生物物理特性，以“配体-受体”模式参与细胞间通讯并将信息物质传递到靶细胞内，调节靶细胞内的微环境和相关的蛋白功能。随着对Exos研究的不断深入，发现Exos 参与炎症反应、促进血管再生、控制细胞的增殖和凋亡等过程［14］。随着对Exos 参与创面修复的机制和不同源性Exos 在糖尿病足溃疡修复中的应用深入研究，将来Exos 有可能成为糖尿病足溃疡新的治疗热点。

2 MAPK 信号通路

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是细胞增殖、分化、细胞凋亡以及正常条件和病理条件下应激反应的关键信号通路。MAPK 是一组进化保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，可分为4 个亚族：ERK、p38、JNK 和BMK1（也称：ERK5），分别代表四条经典的MAPK 通路，MAPK 信号通路是一个级联磷酸化的过程。糖尿病足溃疡患者血糖通常不稳定，研究发现长时间升高的葡萄糖不仅刺激胰岛素基因启动子的急性作用，而且升高的葡萄糖抑制胰岛素基因启动子的慢性作用，这取决于ERK1/2 丝裂原活化蛋白激酶活性［15］，另外长期高血糖状态会导致胰岛素基因启动子的葡萄糖反应性丧失和抑制胰岛素基因启动子的活性。总之，这些发现表明，Ⅱ型糖尿病中发生的胰岛素基因转录受损部分是由于ERK1/2 抑制胰岛素基因启动子的因子的磷酸化。LI 等［16］发现结缔组织生长因子（CTGF）在糖尿病足溃疡（DFU）大鼠和患者的溃疡组织中表达不佳，CTGF 过表达可激活MAPK 信号通路以促进细胞增殖、ECM 重塑、血管生成和伤口愈合，同时抑制细胞凋亡，此外，MAPK 信号通路激活被证实是lncRNA H19/CTGF/SRF 诱导结果背后的潜在机制。而李洋等［17］对DFU 大鼠使用Z-没药甾酮（Z-GS）发现创面炎性细胞浸润减少，毛细血管含量丰富，采用Western blot 检测大鼠ERK/MAPK 通路相关蛋白的表达水平，大鼠创面组织中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化MAPK（p-MAPK）蛋白表达水平升高，他们推测Z-GS 可能通过激活ERK/MAPK 通路对糖尿病大鼠皮肤溃疡发挥祛腐生肌的作用。MAPK 信号转导通路尤为重要，XU 等［18］发现在DFU 组织中，下调的lncRNAENST-000041154和上调的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）1 之间存在靶向调节关联，并且在该RNA 和蛋白质之间检测到负相关，而且其研究结果表明，T 淋巴细胞的免疫功能紊乱可能与DFU 的发生密切相关，lncRNA-ENST000041154/MAPK1 轴介导的MAPK信号转导通路的激活可能会影响DFU 免疫调节失衡。WANG 等［8］对13 例糖尿病足溃疡患者采用负压创面治疗，发现负压伤口治疗能有效缓解炎症反应，降低治疗7 d 后白细胞介素-6、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 和P-c-JunN 末端激酶水平，他们认为负压伤口治疗可能通过抑制糖尿病足患者的白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 和诱导型一氧化氮合酶来抑制伤口炎症，这种效应可能至少部分通过MAPK-JNK信号通路介导。TAN 等［19］发现在正常血糖条件下，Ach 通过Src 细胞外信号调节ERK1/2 途径上调TGFβRII，从而增强TGFβ1 介导的上皮-间质转化，但在高血糖环境下，KC 对升高的内源性乙酰胆碱无反应。他们通过进一步研究表明，在高糖条件下，p38 MAPK 的激活干扰了Src 细胞外信号调节激酶1/2 信号，导致乙酰胆碱抵抗，因此高血糖抑制乙酰胆碱诱导的角质形成细胞-上皮-间质转化可通过抑制p38 MAPK 来缓解，从而改善创面修复。由此可见，可以通过干预MAPK 信号通路达到控制血糖、缓解炎症反应态，达到促进创面修复的目的。

3 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt 信号通路是哺乳动物上皮细胞和毛囊（HFs）中重要的成年哺乳动物干细胞（ASC）调节因子。Wnt 家族至少由19 个基因组成，包括Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-10b 和Wnt-7a。Wnt 蛋白通过Wnt 受体卷曲（FZD）和共受体LRP5 和LRP6 诱导β-连环蛋白依赖性信号传导来调节细胞增殖和分化以及干细胞的自我更新，以调节细胞生长和修复［20］。Wnt/β-catenin 信号通路是创伤愈合调节的主要过程之一，可促进创伤血管生成和上皮重塑，对及时愈合伤口至关重要，YANG 等［21］发现在糖尿病大鼠实验中LRG1 主要通过激活Wnt/β-连环蛋白途径促进血管生成和糖尿病伤口愈合，而Wnt/β-连环蛋白途径在糖尿病伤口中受到抑制。因此，LRG1 可能是治疗糖尿病足的一种可能的治疗策略。lncRNA 牛磺酸上调基因1（TUG1）参与多种细胞的血管生成。然而，内皮祖细胞中TUG1 活性的机制尚未阐明，LI 等［22］在糖尿病小鼠缺血肢体模型中注射TUG1 慢病毒可以刺激血管生成，其研究结果表明，TUG1 通过调节miR-29c-3p/PDGF-BB/Wnt 信号通路恢复高糖处理的内皮祖细胞的功能。Wnt/β-catenin 通路是一种高度保守的信号转导通路，参与细胞增殖、凋亡和分化等多种生物学过程。糖尿病患者患有血管病变和并发症，如周围神经炎、周围血管病变和胶原异常，导致皮肤伤口难以愈合，并经常发展为慢性溃疡，而皮肤溃疡的愈合需要炎症反应、伤口增殖、重塑调节和干细胞控制。可见Wnt/β-catenin 是皮肤伤口愈合的重要途径，Wnt/β-catenin 通路在糖尿病溃疡炎症反应、伤口增生、伤口重塑和干细胞中发挥着重要作用。皮肤溃疡是糖尿病的严重并发症，糖尿病患者患有血管病变和胶原异常等情况往往导致创面难以修复而发展为慢性溃疡。皮肤溃疡的愈合需要炎症反应、伤口增殖、重塑调节和干细胞控制等综合作用。

3.1 Wnt/β-Catenin 通路与DFUs 创面炎症DFU患者的难治性伤口可能与炎症负性调节因子（如EOLA1）表达减少导致的细胞内炎症通路的不可控激活密切相关，这种表达减少也可能与持续性炎症状态密切相关［23］。炎症是一种重要的保护性反应，在受损组织的再生和消除触发因素（外源性生物体、死亡细胞或物理刺激）中起着关键作用。不良的炎症反应可能会增加有害的触发因素，尤其是细菌对组织的破坏，而慢性未解决的炎症可能会导致病理变化，包括DFUs 伤口和其他类型的伤口愈合。DFUs 愈合和损伤修复通过恢复屏障功能促进问题解决。传统的炎性细胞因子和Wnt因子控制哺乳动物组织修复和再生的细胞和分子水平。干扰素-γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）可以有效刺激炎症因子，从而导致Wnt5a 的显著上调［24］，进而改善创面炎症反应。ZHANG 等［25］发现白细胞介素-25 介导（IL-25 蛋白）的白细胞介素17 受体B（IL-17RB）上调通过改善内皮细胞功能，IL-25 介导的IL-17RB 信号传导降低Wnt/β-catenin 通路的下调，并诱导了高糖条件下AKT 和ERK 1/2 的磷酸化，局部施用重组IL-25 蛋白可改善伤口床的血管生成和胶原沉积，从而改善延迟的糖尿病伤口愈合。何丰来等［26］发现银杏叶提取物可改善糖尿病足溃疡大鼠创面炎症和氧化应激反应，升高生长因子水平，调控Wnt/β-catenin 通路蛋白表达进而促进大鼠创面愈合。炎症是创面修复的第一阶段，随后是组织形成和重塑，Wnt/β-Catenin 通路参与DFUs 伤口炎症介质等方面进行促进创面愈合。

3.2 Wnt/β-Catenin通路与DFUs创面增生DFUs伤口发炎后，组织通过分泌成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞形成增殖期。成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）和PDGFs 调节修复细胞的激活和增殖，成纤维细胞分泌的大量毛细血管、胶原和细胞外基质的形成构成肉芽组织，角质形成细胞的增殖覆盖伤口表面，以实现DFUs 创面的修复。Wnt5a在糖尿病血管内皮细胞功能障碍中的作用近年来备受关注，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的内皮细胞具有更高的Wnt5a 表达，在体外，抑制糖尿病患者内皮细胞中的Wnt5a 可恢复胰岛素诱导的eNOS 磷酸化和NO 生成，这是由JNK 介导的，这表明Wnt5a/JNK 信号通路参与了糖尿病的内皮功能障碍［27］。研究表明［28］β-连环蛋白在调节皮肤伤口愈合中起着关键作用，β-连环蛋白在角质形成细胞和成纤维细胞中发挥不同的作用，抑制角质形成细胞迁移和激活成纤维细胞增殖来调节细胞增殖、分化和迁移过程，进而调节创面伤口愈合。Wnt/β-catenin 信号传导通路调节影响皮肤成纤维细胞和皮肤纤维化的特定lncRNA，β-连环蛋白信号响应性lncRNA 可以调节真皮纤维化中的真皮成纤维细胞行为和胶原蛋白积累，为治疗干预提供新的机制见解和节点［29］。Wnt 信号通路似乎在干细胞活性的再生中起着核心作用，但是这方面还需要进一步研究。

3.3 Wnt/β-Catenin通路与DFUs创面重建DFUs创面重建是创面愈合的重要时期。在早期细胞外伤口基质形成后，胶原骨架和填充在基质中的蛋白多糖通过细胞凋亡和成熟产生疤痕张力。皮肤伤口中的成纤维细胞积累需要成纤维细胞的表型调节，成纤维细胞转变为肌成纤维细胞表型，沿着质膜的细胞质面充满肌动蛋白束，当这些肌成纤维细胞通过延伸伪足聚集在伤口细胞外基质中时发生伤口收缩，附着于细胞外基质分子，例如纤连蛋白和胶原蛋白，然后缩回伪足，一旦完成了这些过程，成纤维细胞就会出现凋亡，因此，在皮肤伤口修复过程中，成纤维细胞似乎经历了四种表型：第一次增殖，第二次迁移，第三次合成细胞外基质分子，第四次将粗肌动蛋白束表达为肌成纤维细胞［30］。在组织修复的后期，成纤维细胞进入凋亡，最后导致伤口表面收缩。Wnt/β-catenin 是DFUs创面重建发展过程中关键的激活起始信号之一，大量角质形成细胞开始增殖，并在细胞周期中发挥调节作用。因此可见，Wnt/β-连环蛋白信号通路可以通过影响人成纤维细胞的增殖来影响DFUs 创面重建。

3.4 Wnt/β-Catenin 通路与干细胞调控Wnt/β-连环蛋白途径在ASC 的内环境稳定中起作用，是炎症组织再生的焦点。已有报道称［31］自体干细胞移植可以治疗下肢DFUs，例如间充质干细胞。Wnt 信号通路是哺乳动物上皮细胞和毛囊（HFs）中重要的成年哺乳动物干细胞（ASC）调节因子，与持续再生的表皮不同，成熟HFs 在其整个生命周期中经历生长、退化和静止周期。在毛发发育周期中，HFs 的上部是永久性的，而下部经历变性，然后由干细胞再生，毛囊干细胞起源于毛基生发细胞的上部，其Wnt/β-连环蛋白信号减弱。胚胎表皮细胞中Wnt/β-连环蛋白信号的增强消除了毛囊干细胞的特异性［32］。毛囊干细胞（HFSc）具有多向分化潜能并参与皮肤伤口愈合过程，LncRNA PlncRNA-1 通过TGF-β1 介导的Wnt/βcatenin 信号通路调节毛囊干细胞的增殖和分化［33］。Wnt/β-Catenin 通路参与干细胞调控机制影响干细胞分化进而干预DFUs 创面修复过程。

4 NF-κB/NLRP3 炎性小体信号通路

NF-κB 由DNA 结合亚基p50 和反式激活亚基组成，NLRP3 属于模式识别受体。NF-κB 在血管周围的巨噬细胞和分布在血管周围的结节组织细胞中表达，内皮素-1（ET-1）在基质区毛细血管前血管周围的炎性细胞中表达。糖尿病足溃疡内皮细胞中ET-1 的表达会导致胰岛素抵抗，并诱导巨噬细胞产生NF-κB，调节溃疡创面的炎症反应［34］。有研究表明［35］短暂的高血糖会对血管内皮造成持续性损伤和直接上调DNMT1 的表达，导致Ang-1的高甲基化，降低Ang-1 的表达，进而诱导NF-κB的长期激活和随后的血管内皮功能障碍，抑制DNMT1 可通过调节Ang-1/NF-κB 信号通路促进血管生成和加速糖尿病伤口愈合。HUANG 等［36］发现对DFU 小鼠给与高压氧治疗（HBOT）能够促进HIF-1α、NF-κB 和CXCR4 等的表达，HBOT 促进人皮肤成纤维细胞（HSF）的增殖、迁移和血管形成，进而促进DFU 小鼠创面愈合。而ANGUIANOHERNANDEZ 等［37］对DFU 患者给予HBOT 治疗后发现HIF-1α 和NF-κB 主要在细胞核中表达，治疗后VEGF 表达有显著改变，血浆促炎性IL-6 水平升高，IFN-γ 水平降低，并观察到溃疡创面纤维化和血管生成的增加。由此可见辅助性HBOT 改变了与细胞缺氧反应相关的促炎平衡来促进溃疡创面的愈合。SUN 等［38］给DFU 大鼠服用芍药苷后发现创面炎症细胞减少，芍药苷能够降低趋化因子受体CXCR2 和NF-κB 表达水平，NLRP3 和切割的caspase-1 水平也降低。进一步的体外证据证实，芍药苷通过抑制CXCR2 可以有效抑制DFU 中NLRP3和NF-κB 介导的炎症，进而促进DFU 大鼠伤口炎症显著减轻，伤口愈合更好。而YANG 等［39］对DFU大鼠给与伊布替尼治疗后发现伊布替尼能够降低血糖，降低炎症因子的水平，促进溃疡愈合，提高溃疡愈合率，降低TLR2、TLR4、RAGE 和NF-κB的表达，并增加VEGF 的表达；他们认为伊布替尼可能通过调节RAGE/NF-κB 途径上调VEGF 表达，抑制TLRs 表达，抑制炎症因子分泌，促进糖尿病足溃疡愈合。综上所述，可以通过调控NF-κB/NLRP3 炎性小体信号传导通路来改善细胞缺氧反应，抑制炎症因子的分泌，恢复血管内皮功能，促进血管形成以促进溃疡愈合。

5 Notch 信号通路

Notch 信号在膜结合Notch 受体（Notch 1-4）和配体（锯齿状1-2 和Delta 样1、3、4）相互作用时被激活。Notch 信号通路被激活后释放活化形式ICN，ICN 移动至细胞核与CSL 蛋白结合形成复合物，发挥Notch 靶基因的转录。Notch 对于伤口愈合的早期炎症阶段至关重要，并指导巨噬细胞依赖性炎症介质的产生，典型的Notch 信号传导对于指导巨噬细胞在伤口修复中的功能很重要，并确定了治疗糖尿病伤口的转化靶点［40］。ZHENG等［5］报告Notch1 信号被糖尿病皮肤中的高血糖激活，并特别损害糖尿病患者的伤口愈合，而且他们还发现抑制Notch1 信号能够促进糖尿病动物创面愈合，并认为从机制上讲，高糖水平激活了一个特定的阳性Delta-like 4（Dll4）-Notch1 反馈回路。随后他们利用功能丧失遗传学方法，证明了角质形成细胞中Notch1 失活足以抵消Dll4-Notch1 环对糖尿病伤口愈合的抑制作用，从而使Notch1 信号成为治疗DFU 的一个有吸引力的局部治疗靶点。EBRAHIM 等［41］对DFUs 大鼠使用富含血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）+脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）治疗后发现在7 d 和14 d 后的伤口愈合好，治疗导致了再上皮化和肉芽组织形成，胶原的面积百分比、表皮厚度和血管生成显著增加，此外，Notch 信号显著下调，表皮干细胞（EPSCs）增殖和募集增强，这些数据也表明，PRP 和ADSCs 联合治疗可以通过调节Notch 通路、促进血管生成和EPSC 增殖，显著加速实验性糖尿病大鼠创面的愈合。WANG 等［42］研究发现人脐静脉内皮细胞系（HUVECs）经不同浓度的虹膜素（irisin）、正常葡萄糖、高糖（HG）、HG 加虹膜素高（H）或sh-Notch1 处理后，通过细胞功能实验检测细胞生物学行为和LDH，Western blot 检测凋亡和Notch 通路相关蛋白水平，发现鸢尾素（鸢尾素是一种在小鼠和人类中新发现的肌动蛋白）没有细胞毒性，鸢尾苷-H 可提高HUVEC 的细胞活力，抑制细胞凋亡和LDH 水平，同时，irisin-H 恢复了HG 抑制的HUVECs 迁移和血管生成。在HG 处理的HUVECs 中，Irisin-H 抑制凋亡相关蛋白水平，并促进Notch 通路相关蛋白水平。鸢尾苷通过Notch1 激活Notch 通路，恢复HUVEC 细胞损伤和血管生成，从而促进DFUs 创面愈合。综上所述，通过干预Notch 信号通路可以调控增强角质形成细胞和EPSCs 增殖和募集，提高HUVEC 的细胞活力，抑制细胞凋亡等来诱导再上皮化、肉芽组织形成、增加表皮厚度和血管生成，减轻炎症反应，从而促进DFUs 创面的愈合。

6 结语与展望

综上所述，DCU 是一种难治性慢性创伤，是糖尿病的严重并发症。DCU 的修复和愈合需要多种细胞、细胞因子、细胞外基质、基因等因素的参与，共同构成一个复杂的生物调控网络，涉及众多信号通路，包括包括外泌体（exosomes，Exos）、Notch、NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK 等。其具体作用机制尚不清楚，因此，需要进一步的研究来阐明以更好地理解溃疡愈合的分子机制，这将有助于为慢性溃疡伤口提供更好的治疗和先进的解决方案。近年来，DFU 愈合研究包括减轻炎症反应、恢复血管内皮功能、促进组织和血管再生等，随着精准治疗理念和分子靶向治疗的推广，信号传导通路的调节作用备受关注。本文提及的DFU 相关信号通路的作用机制还没有彻底研究清楚，所以还需要广大科研工作者共同深入研究来阐明以更好地理解和明确溃疡愈合的分子机制，这将有助于为慢性溃疡伤口提供更好的治疗和先进的解决方案。

【Author contribution】LUO fuqiang wrote the article. YU dianbo performed the supervision. LI zaiyong and XIE kangqi revised the article.ZHOU haidong and LUO changtai searched part of literature. WEI jihua performed funding acquisition and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.