甘肃板蓝根品质与产区气候因子相关性研究

李晓琴 ，马栋 ，晋玲， ，温雅 ，薛幸嫔 ，田怡 ，马毅，

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000； 2.西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃 兰州 730000

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥根，其性寒，味苦，归心、胃经，具有清热解毒、凉血利咽功效，主要含生物碱类、氨基酸类、有机酸类、木脂素类、核苷类等成分[1]。关于板蓝根药材品质，《中华本草》指出“以条长、粗大、体实者为佳”[2]。在实际生产过程中，一般将板蓝根主根粗长者列为上品[3]。1984年颁布的《七十六种药材商品规格标准》以“根呈圆柱形，长17 cm以上，芦下2 cm，外直径1 cm以上为一等品；根呈圆柱形，芦下直径0.5 cm以上为二等品”[4]划分板蓝根商品规格等级。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）明确规定板蓝根醇溶性浸出物不得少于25.0%、(R,S)-告依春不得少于0.020%[5]。在同一商品规格下，用于区分交易品种质量优劣的标准为商品等级，而不同等级之间的板蓝根存在着一定的质量差异[6]。在自然条件下，植物生长发育、器官形成及次生代谢产物积累与气候因子密切相关[7]，不同气候下生长的药材其品质会有差异[8]。因此，明确药用植物次生代谢产物合成和积累的主导气候因子是保证药材良好品质的关键。板蓝根作为甘肃省大宗药材之一，不同产地药材外观性状与化学成分存在一定差异，然而鲜有其形、质与综合环境因素相关性研究的报道。为此，本研究采用最大熵模型及Pearson相关性分析方法对不同产地板蓝根表型性状和活性成分与气候因子的相关性进行研究，为板蓝根的规范化种植及品质提升提供依据。

1 仪器、试药与数据

LC-2040C 3D系列高效液相色谱仪，岛津制作所；HH-4型水浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂；EX2202ZH/E型万分之一分析天平、EX2202ZH/E型百分之一电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；RHP-100型多功能粉碎机，浙江永康市荣浩工贸有限公司。

(R,S)-告依春对照品（批号AF21050951，纯度98%），成都埃法生物科技有限公司；磷酸、甲醇均为色谱纯，无水乙醇为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。板蓝根药材，于甘肃省36个不同产地采集，以“中国板蓝根之乡”民乐县为重点采集地区。经甘肃中医药大学马毅副教授鉴定，为十字花科菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥根。2020年秋季采挖，除去泥沙，晒干保存。样品产地见表1，样点分布见图1。

表1 板蓝根药材样品产地

图1 甘肃省板蓝根样点分布

综合考虑板蓝根种植情况，一般在每年4月栽播、10月底采收，故剔除11月至次年3月的气候指标[9]，利用地理信息系统软件ArcGIS10.2从全球气候数据库（http://www.worldclim.org/）提取并下载4－10月均温（tavg）、降水量（prec）、辐射（srad）、水汽压（vapr）共28个气候因子数据。

2 方法与结果

2.1 根系性状测定

每个样地随机选取处理好的10株健康样株，测量并记录其根长、根系直径、根干质量。数值型数据取10株样株的平均值。其中，根长为最长根长，根系直径为根部最粗处直径；根长均用直尺测量，根系直径用游标卡尺测量，根干质量用百分之一电子天平称量。

2.2 浸出物含量测定

参照2020年版《中国药典》通则2201水溶性浸出物测定法的热浸法测定。

2.3 (R,S)-告依春含量测定

参照2020年版《中国药典》板蓝根项下含量测定项规定方法测定。

2.3.1 色谱条件

采用Agilent HC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.02%磷酸水溶液（7∶93），流速0.6 mL/min，进样量10 µL，检测波长245 nm，柱温30 ℃。理论塔板数按(R,S)-告依春计不小于5 000。在此色谱条件下对照品有稳定的指标成分峰且样品峰分离度理想。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取(R,S)-告依春对照品1.00 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为40.0 μg/mL的(R,S)-告依春对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备

精密称定板蓝根药材粉末（过4号筛）约1 g，置锥形瓶中，加水50 mL，称定质量，煎煮2 h，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，静置5 min，吸取上清液，16 000 r/min离心6 min，取上清液，即得。

2.3.4 线性关系考察

分别精密吸取40 μg/mL(R,S)-告依春对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，注入高效液相色谱仪，以进样量（μg）为自变量、峰面积（mAU）为因变量建立回归方程：Y=3×106X+2 766.1（R2=0.999 8）。结果表明，(R,S)-告依春进样量在0.02～0.8 μg范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

取上述40.0 μg/mL (R,S)-告依春对照品溶液，连续进样6次，测得(R,S)-告依春峰面积RSD=1.8%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取板蓝根样品（B30）粉末（过4号筛）1 g，按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别测定，计算(R,S)-告依春含量RSD=2.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，于0、2、4、6、8、10、12 h分别进样，测定(R,S)-告依春峰面积，计算其RSD=0.5%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的同一份板蓝根样品粉末共9份，每3份为一组，分别精密加入相当于样品中含量80%、100%、120%的(R,S)-告依春对照品。按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果平均加样回收率为99.24%，RSD=1.13%，见表2。

表2 (R,S)-告依春加样回收率试验结果

2.3.9 样品含量测定

按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，测定板蓝根样品中(R,S)-告依春含量。

2.4 复合常数构建

基于复合质量常数[10-11]，将36个产地板蓝根的外观性状、浸出物含量及(R,S)-告依春含量相结合，计算复合质量常数，用于板蓝根药材质量评价。质量常数相对质量常数复合常数A+=式中，h为根长，c为待测含量，m为根干质量，L1为2020年版《中国药典》含量测定指标性成分规定限量值，L2为2020年版《中国药典》浸出物规定限量值。计算结果见图2。

图2 36个不同产地板蓝根样品评价参数

由图2可知，36个产地板蓝根药材样品根长为11.89～24.00 cm、根干质量为3.93～22.56 g、根系直径为0.74～1.33 cm；醇浸出物平均含量为34.90%～56.44%；(R,S)-告依春含量为0.023 6%～0.122 5%，各组参数差异较大，表明不同产地气候因子影响板蓝根药材品质。基于复合质量常数，板蓝根样品质量以B15质量最佳，B25、B24、B12次之。

2.5 气候因子提取与筛选

利用ArcGIS10.2软件的空间分析模块功能将28个气候因子值提取至板蓝根采集点，转换数据；应用MaxEnt3.4.4软件，使用刀切法（Jackknife）评价气候因子的权重，随机选取75%数据进行建模，通过25%数据作为测试数据进行验证，经2次运算去除贡献率为0的变量，板蓝根生态分布模型均AUC>0.9，数据AUC=0.998，验证数据AUC=0.998，表明模型精确度极好，可信度高。选取累计贡献率>95%的生态因子，初步筛选出12个生态因子，见表3。

表3 影响板蓝根品质的气候因子贡献率（%）

2.6 药材品质与气候因子相关性分析

采用双变量相关性分析方法，以气候因子参数作为自变量，化学成分含量为因变量。采用SPSS25.0软件对其进行Pearson相关分析，明确与板蓝根品质具有相关性的气候因子，结果见图3。

图3 气候因子与板蓝根样品评价参数Pearson相关性分析

在性状方面，(R,S)-告依春含量与主根直径呈极显著负相关，与根干质量呈显著负相关。气候因子方面，根系直径与10月辐射呈显著正相关，与4、10月降水量呈显著负相关；醇浸出物含量与4、10月均温，7月水汽压呈正相关；(R,S)-告依春含量与4、6、10月降水量及7月水汽压呈显著正相关，与8、9月降水量呈极显著正相关，与8、9月辐射呈显著负相关。

3 讨论

本研究在可控范围内尽量保持样品一致性，对甘肃省36个产地的板蓝根根长、根系直径、根干质量、醇浸出物含量、(R,S)-告依春含量进行测定，发现不同产地气候因子下每组参数差异较大。其中以民乐县顺化镇板蓝根药材复合质量常数最大，质量最佳，最适宜板蓝根种植。但民乐县13个样地复合质量常数参差不齐（6.77～26.67），考虑板蓝根肉质根的生长、成熟及(R,S)-告依春作为次生代谢产物对遗传特性的影响外，很大程度上受生长环境、气候、土壤等因素直接或间接影响。在经纬度等地理因子，光照[12]、温度[13]、水分[14]等气候因子和土壤肥力[15]等生态因子的综合作用下，板蓝根的生长发育过程受到调节，表现出各产地间药材外观性状、活性成分含量均出现较大差异性。气候因子是生态环境中的重要因子[16]，因此，深入探讨气候因子对药用植物生长发育的影响，对于提高药材品质及药用植物生产规范化、现代化、规模化具有重要意义。

MaxEnt3.4.4软件基于最大熵原理，以物种分布和环境变量为基础，利用数学模型统计分析熵最大时物种的分布状态，在分布数据较少时，最大熵模型的预测结果比同类预测模型更精确[17]。本研究基于最大熵模型从28个气候因子数据中提取对板蓝根具有贡献率的12个气候因子，再对其与板蓝根根部参数及活性成分进行Pearson相关性分析，结果显示辐射及降水量是影响板蓝根品质的关键因素。

板蓝根的生长期可分为4个阶段，依次是苗期（5－6月）、营养生长期（6－7月）、肉质根生长期（7－9月）、肉质根成熟期（9－10月）[18]。营养生长期是板蓝根扎根生长的关键时期，这一时期太阳辐射量逐渐升高，地上部分快速增长，密度增大遮盖地表，一定程度上减弱了地表蒸发，但该时期植株叶片蒸腾作用逐渐增强，同时大气温度较高，蒸发量大，需要足够的水分来保证下一阶段肉质根的正常生长，而8、9月降雨量达到全年最高，充分保证了肉质根的生长与成熟；根系进入肉质根成熟期后，根部开始迅速膨大，蒸腾作用也随气温逐渐降低而逐渐减弱，植株的生长中心转移，地上部将养分输送到地下开始进行有效成分的积累，需水量也表现下降趋势，降水量减少恰好符合这一需求；这一时期也是地下部分有效成分积累的关键时期，有效成分产量主要来自光合作用，太阳辐射却在逐渐减少，不利于有效成分的积累，故表现出8、9月太阳辐射与(R,S)-告依春含量呈显著负相关。此外，在地理因素上，本次调研区域内随着地区的变化年均太阳辐射总量降低和降水量增加可以促进(R,S)-告依春含量的积累，表现为从西向东由河西地区向陇东地区推进，板蓝根中(R,S)-告依春含量升高，从南向由陇南地区向陇中地区推进，板蓝根中(R,S)-告依春含量升高；但河西地区的板蓝根(R,S)-告依春含量相对较低，具体原因还需进一步实地调研和分析。

综上所述，板蓝根品质的形成与气候因子密切相关。7－10月太阳辐射和降水量对板蓝根的栽培有显著影响，这与板蓝根喜温暖、怕水涝[19]的习性一致。此外，在实现板蓝根药材“优形”和“优质”的双重条件下，还要关注其他栽培条件，有研究分析播种期与板蓝根形态学特征、产量及质量均呈负相关[20]，提示在板蓝根规范化种植过程中不仅要考虑选址，还要综合考虑播种期等其他因素，以提高药材品质。