健脾益肾降浊方对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠血清中炎症因子的影响※

赵惠叶 刘红利 田金悦△ 赵重阳 李 洋

(1.河北省石家庄市第二医院糖尿病中医科，河北 石家庄 050035；2.河北省石家庄市中医院儿科，河北 石家庄 050011；3.河北省石家庄市糖尿病精准诊疗技术创新中心，河北 石家庄 050035；4.河北省糖尿病基础医学研究重点实验室，河北 石家庄 050035)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常见的并发症之一，是导致终末期肾病的重要原因之一，近年研究发现DKD患者体内存在持续的微炎症状态[1]。微炎症状态是一种有别于病原体感染的炎症，其表现为全身循环低水平、持续性的炎症因子升高而并无明确的病原体感染[2]。在DKD早期即可出现微炎症状态，随着病情逐渐加重，会加快患者肾功能的降低及肾实质的损伤。因此调节DKD的微炎症状态成为减缓疾病进展的治疗新思路。目前，现代医学主要采用降压、降糖、降脂等方法治疗，中医从整体出发，辨证论治，在治疗DKD方面有一定优势。DKD属中医学“消渴”“水肿”“尿浊”等病证范畴，在疾病早期多表现为脾肾两虚，夹瘀夹浊[3]，病位在脾肾，瘀浊内蕴，伤及五脏。因此我们制定了以“健脾益肾，降浊化瘀”为治疗原则的健脾益肾降浊方。健脾益肾降浊方以《金匮要略》防己黄芪汤为基本方，加用固肾化瘀降浊之品以着重增强益肾通络、化瘀降浊之效。本实验研究主要观察不同剂量的健脾益肾降浊方对DKD大鼠炎症因子的影响，以期为健脾益肾降浊方的临床研究提供实验基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，日龄90天，体质量(150±20)g。购自北京维通利华动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0009。于河北省糖尿病基础医学研究重点实验室进行饲养，观察1周后开始实验。

1.2 药品及试剂

1.2.1 药品 缬沙坦胶囊(80 mg，常州四药制药有限公司，国药准字H20010824)；健脾益肾降浊方(由神威药业集团有限公司提供中药颗粒剂)药物组成：黄芪20 g，防己15 g，白术15 g，山药15 g，山茱萸15 g，地龙10 g，蒲黄15 g，泽兰15 g，生半夏6 g。

1.2.2 试剂 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；血肌酐(SCr)、血糖、24 h尿微量白蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Anti-白细胞介素6(IL-6)抗体、Anti-IL-8抗体、Anti-肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体、Anti-C Reactive Protein(CRP)抗体(美国美源伯根公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(购于北京索莱宝生物科技有限公司)。

1.3 仪器 ELx800TM酶标仪(美国Bio-Tek公司)；Leica RM2235石蜡切片机(德国徕卡公司)；AU2700全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司)；CX31显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立 将SD大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为正常组(n=10)和造模组(n=50)。正常组大鼠予普通饲料饮食，造模组大鼠予高糖高脂饲料(含猪油30%、白糖30%、蛋黄6%、普通饲料44%)。5周后禁食12 h，造模组大鼠予腹腔注射STZ 30 mg/kg，每日1次，连续注射3天。正常组大鼠予注射等容积0.9%氯化钠注射液，每日1次，连续注射3天。然后取造模组鼠尾静脉血，测血糖≥16.7 mmol/L，确认糖尿病造模成功。连续喂养4周后，监测大鼠的24 h尿蛋白定量>30 mg且尿液葡萄糖呈阳性，则认为DKD模型成功[4]。3只大鼠造模失败，剔除。

1.4.2 分组与给药 将大鼠分为正常组10只，将47只DKD大鼠按随机数字表法分为：模型组10只，缬沙坦组10只，健脾益肾降浊方低、中、高剂量组各9只。依据人与大鼠药物剂量折算公式[5]，缬沙坦组予缬沙坦胶囊0.131 g/kg灌胃，健脾益肾降浊方低、中、高剂量组分别予健脾益肾降浊方1.032、2.064、4.128 g/kg灌胃，正常组、模型组大鼠予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，每日1次。期间每周检测体质量并调整灌胃剂量，连续12周。

1.5 观察指标及方法 各组大鼠灌胃12周后禁食不禁水12 h，使用异氟烷吸入麻醉，腹主动脉取血，离心机3000 r/min离心10 min，分离血清和血浆。采用生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)、SCr；采用酶联免疫吸附法检测血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平。用代谢笼收集大鼠尿液，检测24 h尿微量白蛋白水平。将大鼠左肾沿纵轴切开，取多块肾皮质组织，取5 μm厚肾皮质置于4% 多聚甲醛中性溶液中固定，石蜡包埋，用于HE染色。于200倍光镜下观察大鼠的肾脏组织。

2 结果

2.1 各组大鼠FPG、2 hPG水平比较 与正常组比较，模型组大鼠FPG、2 hPG水平均升高(P<0.05)；与模型组、缬沙坦组、健脾益肾降浊方低剂量组比较，健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠FPG、2 hPG水平均降低(P<0.05)。健脾益肾降浊方中、高剂量组组间大鼠FPG、2 hPG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、健脾益肾降浊方低剂量组、缬沙坦组FPG、2 hPG水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FPG、2 hPG水平比较

2.2 各组大鼠SCr水平比较 各组大鼠SCr水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠SCr水平比较

2.3 各组大鼠24 h尿微量白蛋白比较 与正常组比较，模型组大鼠24 h尿微量白蛋白水平升高(P<0.05)；与模型组比较，缬沙坦组及健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠24 h尿微量白蛋白水平均降低(P<0.05)，健脾益肾降浊方低剂量组无明显改善(P>0.05)；与健脾益肾降浊方低剂量组比较，健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠24 h尿微量白蛋白水平均降低(P<0.05)；与健脾益肾降浊方中剂量组比较，健脾益肾降浊方高剂量组大鼠24 h尿微量白蛋白降低(P<0.05)。缬沙坦组与各中药组24 h尿微量白蛋白水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠24 h尿微量白蛋白比较

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平比较 与正常组比较，模型组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，缬沙坦组及健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)，健脾益肾降浊方低剂量组IL-8、CRP水平均降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平无明显改善(P>0.05)；与缬沙坦组比较，健脾益肾降浊方低剂量组IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平无明显改善(P>0.05)，健脾益肾降浊方中剂量组IL-8、CRP水平降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平无明显改善(P>0.05)，健脾益肾降浊方高剂量组IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)；与健脾益肾降浊方低剂量组比较，健脾益肾降浊方中剂量组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低(P<0.05)，CRP水平无改善(P>0.05)，健脾益肾降浊方高剂量组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)；与健脾益肾降浊方中剂量组比较，健脾益肾降浊方高剂量组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平比较

2.5 各组大鼠肾脏病理变化 正常组大鼠肾脏组织病理表现为肾小球结构清晰，上皮细胞排列整齐，无炎症细胞浸润。模型组大鼠的肾脏组织发生病理改变，系膜细胞和系膜组织增生，肾小球肥大，基底膜增厚，可见到炎症细胞浸润。与模型组大鼠的病理改变比较，各药物干预组大鼠肾组织病理有不同程度的改善。健脾益肾降浊方中剂量组、健脾益肾降浊方高剂量组改善明显。见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理图(HE，×200)

3 讨论

DKD是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病的重要原因之一。流行病学提示约25%的糖尿病患者出现DKD，其中50%发展为终末期肾病[6]。本病的发病原因复杂，氧化应激、慢性低水平的炎性反应是导致DKD发病的关键因素。越来越多的证据表明持续的微炎症状态是导致终末期肾病的重要原因[7]。与外源性感染不同，微炎症状态是指DKD患者体内持续存在低水平的炎症状态。DKD患者因糖脂代谢紊乱，体内激活及催生了大量炎症因子的分泌，TNF-α、IL-6、IL-8这些炎症因子刺激血管活性物质释放，使肾小球的系膜细胞增生，内皮细胞通透性增加，加速肾脏损伤的进展。在本实验中，模型组大鼠的24 h尿微量白蛋白升高，TNF-α的水平明显升高，且DKD肾脏损伤的程度与TNF-α的升高成正比。在其他的DKD小鼠实验中也可见相似的结果[8]。本研究结果显示，健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠IL-6、IL-8、CRP、TNF-α水平均降低(P<0.05)，健脾益肾降浊方低剂量组大鼠IL-8、CRP水平均降低(P<0.05)。IL-6、IL-8是白细胞介素家族成员，IL-6可使血管内皮细胞上黏附分子的表达增加，通过黏附过多的炎症细胞，导致毛细血管的通透性异常，从而促进DKD的发生发展[9-10]，同时在调节免疫应答、抗感染和炎性反应中发挥重要的作用[11]。有研究发现随着DKD病情严重程度的增加，IL-6明显增加，与尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)呈正相关性，提示IL-6加快疾病的进展[12]。本研究结果显示，不同浓度的健脾益肾降浊方可以不同程度地降低DKD大鼠的血清中IL-6的水平，且随着药物浓度的升高，中药组大鼠血清IL-6、IL-8的水平下降。CRP是一种非特异性急性期反应蛋白，在急慢性炎症及DKD患者中均明显升高，是提示微炎症的可靠指标，在本实验中，DKD大鼠的炎症水平明显升高，高浓度的中药可以更明显地降低CRP的水平。在本实验中还可发现，健脾益肾降浊方中、高剂量组大鼠24 h尿微量白蛋白水平下降(P<0.05)，说明中高剂量的健脾益肾降浊方可以不同程度的改善大鼠的肾脏功能，且具有浓度依赖性。DKD疾病的发生发展与血糖水平的持续偏高相关，体内高血糖水平状态可以导致肾脏微血管的损伤，本实验发现，健脾益肾降浊方中、高剂量组可以降低大鼠FPG、2 hPG水平(P<0.05)。因此我们推测健脾益肾降浊方可以从降低血糖水平、降低炎症因子水平，从而改善肾脏的损伤。

DKD属中医学“尿浊”“水肿”“胀满”“关格”等范畴。近年来，中医药对DKD微炎症状态的理论及临床研究不断取得进展，现代医家将DKD归属于“消渴肾病”。中医学认为，DKD病因为先天禀赋不足，久病消渴。脏腑柔弱是导致DKD的内在因素，劳伤太过、六淫邪毒、情志失调、房劳过度为外在因素。与肺、脾、肾关系密切。肾为先天之本，肾主封藏，肾中精气亏虚，开阖失司，不能濡养他脏，遂逐渐出现口干口燥，精微下泄。脾胃为后天之本，饮食通过脾胃的运化转输，输注于各脏腑，如若长期饮食不节，恣食肥甘厚味，使脾胃损伤，后天之精化生不足，脏腑失养，加之先天之精匮乏，则肾失封藏，精微丢失，进一步导致湿浊、痰浊、瘀血等病理产物的产生，而病理产物的形成又会进一步导致脏腑的亏虚，形成以脾肾亏虚为本，浊毒、血瘀、气滞、痰湿为标，本虚标实，虚实夹杂的病因病机。在《圣济总录》中记载：“消渴……久则渗漏脂膏，脱耗精液，下流胞中，与水液浑浊，随小便利下膏凝……”说明病久是DKD发生发展的重要因素。DKD迁延日久不愈，伤阴耗气，肾络瘀阻，易形成微型癥瘕，故治疗当在健脾益肾、化瘀降浊的基础上加用通络之品，以加强化瘀软坚散结之效。本实验中健脾益肾降浊方便是由健脾利湿的名方防己黄芪汤化裁而成。防己黄芪汤出自《金匮要略·水气病脉证并治》：“风水，脉浮，身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之。”防己黄芪汤补气健脾，除湿祛风，利水消肿，历代医家化裁应用于脾虚、虚劳病、风水、皮水、水气症的治疗。清代医家将此方应用于妇人虚性水肿的治疗。健脾益肾降浊方以防己黄芪汤为主方，加用益肾降浊及活血通络之品以起健脾益肾，利水降浊通络之效。本方组成为黄芪、防己、白术、山药、山茱萸、地龙、蒲黄、泽兰、半夏。方中以黄芪、防己为君药，黄芪，味甘，性温，入肺、脾两经，是健脾益气、升阳举陷的要药，既可健脾肺以扶正，又可益气固表及消肿；防己同为君药，性寒，入脾、胃经，具有利湿行水之功。半夏、白术、山药、山茱萸为臣药，健脾益肾，山茱萸以益肾养阴，还可收敛固涩；半夏、白术、山药健脾化湿。泽兰、地龙、蒲黄为佐药，活血化瘀利水，地龙为虫类药加强走窜通络之效。黄芪与山药配伍，为施今墨治疗糖尿病经典的对药，可达到补脾益肾，敛精固涩之效。现代药理研究发现，黄芪注射液可以降低DKD大鼠TNF-α的水平[13]；黄芪总黄酮可能通过MAPK信号通路调控TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，发挥抗炎作用[14]；黄芪和山药配伍可降低DKD大鼠血糖、24 h尿微量白蛋白，改善肾功能指标，说明黄芪和山药的配伍对大鼠肾脏病理损伤得到一定程度保护[15]；蒲黄总黄酮干预则能抑制IL-6基因表达，减少IL-6分泌[16]；地龙可降低炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达，阻止炎症细胞对肾组织的浸润，进而防止肾小球硬化，延缓DKD进展，还能发挥抗氧化作用，对抗氧化应激对患者机体的进一步损伤，还可以调节DKD相关的细胞因子和抑制肾小球系膜细胞增殖，避免炎症因子的浸润和细胞外基质的积聚，防止肾小球硬化发生和发展[17]。

综上所述，中高浓度的健脾益肾降浊方可以降低DKD大鼠的血糖、24 h尿微量白蛋白及炎症因子的水平，改善大鼠肾组织损伤，进而延缓DKD发展，为进一步的临床研究提供了实验基础。