湖南省多花黄精炭疽病病原鉴定及其药剂筛选

2023-03-31邱泽澜朱俊子

西南农业学报 2023年1期

邱泽澜，陈锦，张卓，钟杰，朱俊子

(1.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2.湖南省农科院农业环境生态研究所, 长沙 410125；3.湖南省农科院植物保护研究所, 长沙 410125)

【研究意义】多花黄精是百合科多年生草本植物，在亚洲分布广泛，可以作为抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗氧化的临床中药材[1-2]。在很多亚洲国家，多花黄精作为茶和观赏植物使用[2]。多花黄精中的多糖是天然药物的主要活性成分，具有很多重要的生物学功能，包括免疫调节活性等[3-4]。多花黄精的生长阶段可被多种病害侵染[5]，随着栽培面积的不断扩大，病害问题也日益突出。其中，炭疽病是对其生产造成严重损失的主要病害之一。因此，鉴定黄精炭疽病病原菌以及对该病原菌的药剂筛选可为科学防治黄精炭疽病提供理论依据，具有重要意义。【前人研究进展】葱炭疽菌(Colletotrichumcircinans)是黄精炭疽病的致病因子[6]。葱炭疽菌是一种最初被确定为导致洋葱炭疽病[7]的病原真菌，广泛分布在温带地区。它也会感染其他植物，包括樟子花、甜菜和硬毛堇菜等[8]。然而，根据现有的形态描述，葱炭疽菌和白蜡树炭疽菌(C.spaethianum)在形态特征上存在一定的差异。如Damm等[8]全面总结了白蜡树炭疽菌和葱炭疽菌的形态特征。白蜡树炭疽菌属于白蜡树炭疽复合种，而葱炭疽菌是束状炭疽复合种的成员[9-10]。当在SNA上培养时，白蜡树炭疽菌的附着胞呈暗棕色，具有不规则轮廓，有时或多或少浅裂，壁部平滑，而葱炭疽菌的附着胞是独立的，呈长椭圆形的棍棒状，有时呈圆锯齿状或稍浅裂，壁部平滑，单细胞或双细胞，浅棕色或中棕色[8,11]。因此，附着胞的形态可能是鉴别两种炭疽菌的有用特征。在对黄精炭疽病的防治上，高秋美等[12]提出，适当提高黄精的栽种密度，可以使黄精植株生长旺盛，植株健壮，抗倒伏能力增强，有效预防病害。种植密度过大则会使植株争夺养分等资源，造成植株弱小，病虫害频发。种植密度过小则会对土地资源造成浪费，无法保证单位面积的产量。因此，合理科学的种植密度是预防黄精植株发生病害的有效方法。南红亮[13]研究表明，在黄精植株苗期、花期可使用健壮药剂，在预防炭疽病等的同时，还能促进黄精根系发达，增大块茎。阴雨天预防炭疽病发生时，可以采用健壮药剂和悦帆欣彤乐组合喷施。在黄精叶片感染炭疽病初期，可使用先正达健壮2000倍液喷施叶片，每7 d喷施1次，连续喷施2～3次。若发病较重，可适当加入40%苯醚甲环唑2500倍液，用喷雾法进行均匀喷施。【本研究切入点】黄精人工培养具有一定难度，近年来病害问题逐步加重，2017—2019年，在湖南省多花黄精上发现了一种叶斑病，表现为炭疽病症状。目前湖南省黄精炭疽病病原还未有报道。【拟解决的关键问题】本研究通过对病样进行分离培养，致病性测定，结合形态学特征并采用多基因系统发育分析，对分离得到的病原菌进行鉴定，并通过室内毒力测定筛选杀菌剂以期为该病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离纯化

2017—2019年分别采集湖南省4个多花黄精种植苗圃中的多花黄精叶片，共采集16份症状相似的多花黄精叶斑病叶。采用组织分离法分离病原菌[14]。在病叶的病健交界处取大小为5 mm×5 mm的组织块，先用70%乙醇消毒30 s，1% NaOCl消毒1 min，再用无菌水冲洗3次，晾干后转移到PDA平板上，于26 ℃黑暗条件下培养。待长出菌落后转接到另一平板上纯化培养。在新鲜的PDA中进行单孢分离，获得纯化的后代。将纯化的菌株转入试管斜面，在4 ℃冰箱保存备用。

1.2 病原菌的形态和培养特征观察

将纯化菌株在PDA平板上培养3 d后，在菌落的边缘打取直径为5 mm的菌饼转接入新的PDA和SNA培养基中央，在26 ℃黑暗条件下培养。观察菌落的颜色和形态，测量菌落直径。在SNA培养基上培养6 d后，收集分生孢子，在光学显微镜下进行显微观察，记录各菌株分生孢子的形态特征和计算孢子大小。利用玻片萌发法[15]，进一步观察分生孢子和附着胞的形态，计算附着胞大小。

1.3 病原菌的分子鉴定

采用CTAB法提取真菌基因组DNA[16]。以提取的DNA作为PCR扩增模板，使用表1所示的引物对3株分离菌株的rDNA内转录间隔区(ITS)、肌蛋白(ACT)、几丁质合成酶(CHS-1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)基因进行扩增[17]。PCR反应的总体系为50 μL，包括基因组DNA 1 μL、PCR Master Mix 25 μL、每对引物各1 μL(10 umol/L)和ddH2O 12 μL。PCR程序为：94 ℃初始变性5 min; 94 ℃变性30 s, 57～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将扩增产物送擎科生物科技有限公司进行测序。测得的序列在NCBI数据库进行BLASTn同源性搜索。由于3株分离菌株的对应序列相同，本研究选择1株具有代表性的分离菌株CLHJY4-3进行后续的系统发育分析。从GenBank中选择炭疽属模式菌株及其他菌株序列作为参考序列，使用MEGA6软件利用邻接法进行ITS、ACT、CHS-1和GPDH多基因联合树构建，以1000次重复的自举法进行检测[18]。

表1 扩增炭疽菌的ITS，ACT，CHS-1和GPDH基因引物

1.4 病原菌致病性测定

用分生孢子悬浮液对盆栽多花黄精进行活体接种以测定分离菌株的致病性。将菌株在PDA培养基上培养20 d，用无菌水洗下分生孢子，制备分生孢子悬浮液，并调节浓度为1×106个/mL。选取长势一致的健康多花黄精苗，用75%乙醇对叶片进行表面消毒后，用无菌水冲洗干净。将配制好的分生孢子悬浮液喷洒于叶片上，每株喷洒10 mL。以无菌水接种作为空白对照。接种后，所有处理植株用塑料袋覆盖2 d保湿，然后在25 ℃、L/D=16 h/8 h的温室中培养，每天观察发病情况。为完成柯赫氏法则，待植株发病后，按上述1.1中方法对发病叶片进行病原菌再次分离，并通过形态学观察和分子鉴定确认分离的病原菌与接种病原菌的一致性。

1.5 杀菌剂对病菌的室内毒力测定

利用菌丝生长速率法测定病原菌对5种常用杀菌剂(97%甲基硫菌灵、97.17%多菌灵、96%戊唑醇、95%咪鲜胺和97%吡唑菌酯)的敏感性。在PDA培养基中溶解相应质量的原药，制备出不同浓度的药剂。每个培养皿中倒入15 mL含杀菌剂的PDA，接种直径为8 mm的病原菌菌饼于培养基中央。以不含杀菌剂的PDA培养基础作为对照，27 ℃恒温培养5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。每个处理重复3次，计算抑制率。抑制率计算公式为：抑制率=[(Gc-Gt)/Gc]×100%，其中,Gc和Gt分别代表对照菌落和药剂处理菌落的直径。取各处理杀菌剂浓度的对数值为自变量(X)，对应处理菌丝生长抑制率为因变量(Y)，用统计回归法进行毒力回归分析。通过各毒力回归曲线计算各杀菌剂的抑制中浓度EC50，比较不同杀菌剂对病原菌的抑制活性。所有数据均采用SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 病害症状特点与病原菌分离

在湖南省多花黄精种植园中出现的炭疽病主要危害叶片。症状表现为叶尖或叶外缘有褐色坏死病斑，外围有黄色晕圈。发病后期，病斑变得不规则，在叶片上迅速扩展，导致叶片卷缩或枯萎(图1-A)。从湖南省4个市(长沙、邵阳、张家界、株洲)的4个多花黄精种植园采集症状相似的病叶采用组织分离法进行病原菌分离。共获得16株菌落形态一致的菌株，并随机选择其中7株进行形态学分析。

2.2 形态和培养特征

将病原菌置于PDA培养基上，27 ℃培养形成圆形、边缘整齐的菌落。病原菌最初产生白色至橙色菌丝体，后来变为浅灰色，菌丝平均生长速率为7.07 mm/d(表2)。培养7 d后，菌落表面产生黑色的分生孢子堆。15 d后，菌落表面产生大量黑色菌核样颗粒结构(图1D～E)。在SNA培养基中培养6 d，产生灰白色棉质气生菌丝(图1F～G)。PDA和SNA上产生的分生孢子均为透明、无裂片、镰刀形或微弯曲，顶端圆形，基部截形，内部含油球。分生孢子大小为(18.4～25.0)μm×(3.9～5.3)μm(表2)。刚毛散生，数量较多且直，深褐色，具有2～3隔，基部平齐，顶端较尖，长度为79～107 μm(图1B～C)。附着胞形状不规则，有多或少的裂纹(图1-H)。根据形态学观察，该真菌可确认为炭疽菌[16]。

表2 具有代表性的分离菌株菌落形态特征

A.采集到的带病斑的多花黄精叶片；D～G.病原菌在PDA和SNA上分别培养6和15 d的菌落形态；B、C、H.分生孢子、刚毛和附着胞。

2.3 分子鉴定

将代表菌株CLHJY4-3的ITS、ACT、CHS-1和GPDH基因片段测序后提交到GenBank数据库中，获得登录号分别为MH453905、MH456881、MH456882和MH456883。在NCBI数据库进行BLASTn搜索显示，测得的ITS、ACT、CHS-1和GPDH序列与白蜡树炭疽菌对应序列有99%～100%的同源性。

将获得的ITS、ACT、CHS-1和GPDH序列与NCBI中检索到的炭疽菌序列构建多基因系统发育进化树，发现CLHJY4-3与白蜡树炭疽菌聚集在一起，形成一个明显的分支(图2)。因此，基于同源性比对和系统发育分析可证明多花黄精炭疽病病原菌为白蜡树炭疽菌。

图2 分离自多花黄精炭疽病菌和其他炭疽菌属基于ITS、ACT、CHS-1和GPDH串联序列的系统发育树

2.4 致病性试验

为确定致病性，将3个代表性菌株的分生孢子悬浮液喷洒接种于健康的活体盆栽多花黄精叶片上。接种4 d后，接种叶片上出现了与田间自然感染相似的炭疽病症状。接种6 d后，病斑坏死区扩大，病斑上可见同心纹排列的小黑点，为分生孢子盘。对照接种植株未观察到症状(图3)。利用组织分离法从接种发病的叶片中重新分离病原菌，形态学和分子生物学技术鉴定证明其与原始接种菌株为同一种病原菌。因此，根据柯赫氏法则，试验中接种菌株为多花黄精炭疽病的病原菌。

A～B.分生孢子悬浮液接种症状

2.5 病原菌对不同杀菌剂的敏感性

室内毒力测定结果表明，各个杀菌剂对病原菌均有一定的抑制作用。根据EC50可知，不同药剂之间的抑制作用差异较大。其中咪鲜胺的抑制作用最强，EC50为0.031 μg/mL，其次为吡唑醚菌酯，EC50为0.048 μg/mL。再次为戊唑醇，EC50为0.252 μg/mL。基托布津和多菌灵的抑制作用相对较差，EC50分别为2.911和1.763 μg/mL(表3)。

表3 5种杀菌剂对C. spaethianum菌丝生长的抑制作用

3 讨论

本研究对采自湖南省的多花黄精炭疽病样品进行组织分离、纯化、科赫氏法则验证获得病原菌菌株。根据病原菌株培养形态、显微观察形态、多基因序列系统发育分析和致病性试验，鉴定引起该多花黄精炭疽病的病原菌为白蜡树炭疽菌(C.spaethianum)。炭疽病是多花黄精的重要经济病害。以往研究表明，葱炭疽菌(C.circinans)是多花黄精炭疽病的致病菌。然而，对于炭疽病菌，仅通过形态和致病性分析不足以区分到种。本研究基于ITS、ACT、CHS-1和GPDH进行多基因系统发育分析，发现所分离病原菌与典型白蜡树炭疽菌聚在一起。此外，分离出的病原菌形态特征也与白蜡树炭疽菌的一致。因此，本研究为白蜡树炭疽菌是造成湖南省多花黄精炭疽病的病因提供了证据，为该病害的田间防治提供了依据。

炭疽病菌是一种重要的植物病原菌，可以感染许多木本和草本植物、农作物、果树和观赏植物，包括近年来在中国报道的墨兰(CymbidiumsinenseWilld.)[19]、番木瓜(Caricapapaya)[20]、红楠(MachilusthunbergiiSieb.et Zucc.)[21]等，在世界范围内造成重大的产量损失[22-23]。炭疽病菌不仅可侵染果蔬的叶片、茎、块茎和幼苗，同时也是导致果蔬采摘后病害的重要病原菌。此外，炭疽菌也是重要的腐生菌和内生菌，在不同的寄主植物上表现出不同的生活方式[24]。到目前为止，炭疽病菌属的分类十分复杂。鉴定炭疽病菌通常基于形态特征观察和分子鉴定，而包括ITS，ACT，TUB2，CHS-1和GAPDH等基因的多基因序列比较分析则优于形态学鉴定和基于单基因的进化树分析方法，可解决炭疽菌属不同种之间的亲缘关系[25]。本研究采用形态学观察，并结合ITS、ACT、CHS-1和GPDH进行多基因系统发育分析将分离的病原菌鉴定为白蜡树炭疽菌。

白蜡树炭疽菌属于白蜡树炭疽复合种，经鉴定可作为植物病原菌和腐生菌。形态特征为：刚毛的形状表现为圆锥形，附着胞形状不规则，有多或少的裂纹[26-27]。在国内外被报道，其可引起许多植物病害，如韩国的玉簪(Fragrantplantainlily)[28]、巴西的萱草(Hemerocallisflava)[29]、印度的硬皮葱(Alliumledebourianum)[7]。在中国也有报道该真菌对关苍术(Atractylodesjaponica)[4]、前胡(Peucedanumpraeruptorum)[30]、知母(Anemarrhenaasphodeloides)[30]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[31]、卷丹百合(Liliumlancifolium)[32]等植物造成病害。本研究中发现引起多花黄精炭疽病的病原为白蜡树炭疽菌，与Ma等[33]报道的安徽多花黄精炭疽病病原一致，但由白蜡树炭疽菌引起的多花黄精炭疽病在湖南省属于首次发现。

目前，杀菌剂仍是植物病害防治的主要手段。例如，多菌灵、代森锰锌、百菌清已被有效用于防治炭疽病[34]。本研究对5种常用杀菌剂的体外抑菌能力进行测定，咪鲜胺和吡唑醚菌酯对病原菌菌丝生长的抑制能力较好，可作为潜在的杀菌剂，用于防治白蜡树炭疽菌引起的黄精炭疽病病害。虽然这5种杀菌剂在田间的防治效果尚不清楚，但本试验结果可为黄精炭疽病的防治提供理论依据。本研究中，炭疽病主要发生在多花黄精叶片上。虽然多花黄精的药用采收部位是块茎，但对其地上部分的危害严重影响了多花黄精植株的生长，也使多花黄精失去了观赏价值。此外，白蜡树炭疽菌宿主范围广泛，还可侵染多种植物，其发生不仅可能威胁到多花黄精的生产，还可能威胁到其他与多花黄精伴生栽培的中药材种植。因此，应进一步研究有效的防治策略，包括筛选高效防治药剂以减少该病害的危害。由于没有发现病原菌向块茎和根组织的侵染，而多花黄精是一种多年生草本植物，其地上部分在每一个新的生长季节都能生长出来。因此，类似于其他木本植物病害的防治方法，有针对性地修剪受感染的枝叶对防治该多花黄精病害具有积极意义[35]。