豆天蛾江苏种群滞育期间营养物质及激素变化规律

郭明明，陆明星，赵雪君，李晓峰，陈 凤，樊继伟

(1.连云港市农业科学院/江苏徐淮地区连云港农业科学研究所，江苏 连云港 222000；2.扬州大学，江苏 扬州 225009；3.江苏省灌云县植物保护站，江苏 连云港 222200)

【研究意义】豆天蛾(ClanisbilineatatsingtauicaMell)属鳞翅目(Lepidoptera)天蛾科(Sphingidae)云纹天蛾亚科(Ambulicinae)豆天蛾属(Clanis)[1]。豆天蛾是一种资源昆虫，具有较高的营养价值和医药价值[2]，分析其滞育前后体内营养物质及相关激素的变化规律，有助于进一步探明豆天蛾的滞育机制，为其幼虫绿色高效饲养奠定理论基础。【前人研究进展】豆天蛾江苏种群存在滞育现象[3]，滞育虫态为老熟幼虫，其滞育的发生不仅能够躲避不利环境条件，还可以保证群体发育的一致性，进而提高成虫交配率[4]。昆虫滞育是一个较为缓慢的发育过程，处于滞育期的昆虫，体内代谢活动会产生相应变化，从而保障昆虫存活[5]。如烟蚜茧蜂(Aphidiusgifuensis)滞育个体的海藻糖含量是非滞育个体的 1.5倍以上，山梨醇含量达到滞育初期的1.2倍[6]。七星瓢虫(Coccinellaseptempunctata)的滞育成虫总脂肪含量不断富集，达到(173.66±19.01)μg/mg，是非滞育个体总脂肪含量的2倍以上[7]；滞育还能够引起欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)体内脂肪酸组成成分发生改变，其中滞育个体的三酰甘油组分中，棕榈油酸、油酸等含量会增加，而棕榈酸和亚油酸含量相对减少[8]。中华通草蛉(Chrysoperlasinica)滞育期间，血淋巴中果糖、葡萄糖含量会显著增加[9]。还有研究表明，柞蚕(Antheraeapernyi)和丽草蛉(ChrysopaformosaBrauer)在滞育期间，蛋白质、脂肪及糖类含量等方面均存在一定差异[10-11]。【本研究切入点】与其他研究较多的昆虫，如九香虫(Aspongopuschinensis)、中华通草蛉及蚊科昆虫等相比[12-14]，前人关于豆天蛾滞育的研究相对较少，且对其滞育过程中体内营养物质及激素水平变化还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以豆天蛾江苏种群为试验虫源，分别在滞育前、滞育中和滞育解除后3个不同时期对豆天蛾老熟幼虫体内糖类、可溶性蛋白和脂肪酸等营养成分进行测定，同时分析滞育过程中体内滞育激素水平的变化趋势，为后期深入探究激素参与滞育行为的调控机制及相关生理活动奠定基础，同时也为豆天蛾滞育诱导及解除机制研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

以2021年9月连云港市农业科学院东辛试验基地饲养的同一批刚取食结束的豆天蛾老熟幼虫作为试验虫源。

1.2 试验设计

试验虫源为江苏豆天蛾种群，设置豆天蛾滞育前期(D1)、滞育期(D2)和滞育解除后(D3)3个虫体时期。其D1虫体在豆天蛾幼虫取食结束且即将有入土行为时进行采集；D2虫体在豆天蛾老熟幼虫入土做虫室且停止活动时进行采集，此时豆天蛾幼虫被诱导进入滞育状态[15]；D3虫体在豆天蛾即将化蛹前进行采集，此时豆天蛾滞育幼虫开始活动，并逐渐转移至土表，即被视为解除滞育状态。滞育前期、滞育期和滞育解除后每个滞育状态分别采集10头豆天蛾幼虫，3次重复。采集后的豆天蛾虫体放入透明自封袋(长14 cm×宽10 cm)，每个自封袋中放1头豆天蛾幼虫，密封袋封口后立即放入美国Thermo Fisher公司生产的88400V型超低温冰箱冷冻保存，用于豆天蛾幼虫体内可溶性蛋白、糖原、单糖、氨基酸、脂肪酸含量及保幼激素(Juvenile hormone，JH)、蜕皮激素(Molting hormone，MH)水平的测定。

1.3 测定项目和方法

糖原参照张辉等[16]的方法进行测定。单糖参照韩桂茹等[17]的方法进行测定。可溶性蛋白采用考马斯亮蓝比色法[18]进行测定。

脂肪酸测定。采用美国产安捷伦7890A-5975气相色谱-质谱联用仪，通过GC-MS方法检测样品中多种脂肪酸组分含量。色谱条件：安捷伦毛细管为DB-225 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；气相条件：进样口温度280 ℃；分流比20∶1；升温程序为初始温度50 ℃，5 ℃/min升至200 ℃，2 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；载气 He，载气流量 1.0 mL/min；质谱条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围为 35～800，进样量1 μL。

保幼激素和蜕皮激素测定。取样品置于液氮中研磨粉碎，准确称取0.2 g放入10 mL离心管中，加入2 mL乙酸乙酯；4 ℃ 水浴超声30 min，结束后12 000 r/min离心5 min，取上清液；沉淀中加入2 mL甲醇再提取1次，合并2次上清液；氮气吹干上清液，以0.2 mL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜，采用美国产安捷伦1260液相色谱串联6420A质谱仪进液质检测。色谱条件：色谱柱为poroshell 120 EC-C18反相色谱柱(2.1 mm×150.0 mm，2.7 μm)；柱温35 ℃；流动相A 0.1%甲酸水，流动相B 甲醇；流速 0.3 mL/min；进样体积 2 μL。

1.4 数据分析

采用SPSS 18.0和Excel 2016进行统计分析和绘图，不同滞育时期豆天蛾幼虫体内营养物质含量及激素水平显著性采用Tukey’s HSD test 进行分析。

2 结果与分析

2.1 豆天蛾滞育期间体内糖原、单糖和可溶性蛋白含量变化

从图1可以看出，豆天蛾滞育期间体内3种营养物质含量表现为可溶性蛋白>糖原>单糖，且3种营养物质含量在豆天蛾不同滞育时期均存在一定差异。随着其滞育进程的推进，体内糖原含量不断降低，在滞育解除后(D3)降到最低，仅为11.63 mg/g，显著低于D1和D2时期(F=20.34，df=2，P=0.018)；豆天蛾体内的单糖和可溶性蛋白含量呈先降低后升高的变化趋势，均在D2时期降到最低，分别为2.63和13.28 mg/g。豆天蛾体内的糖原和单糖含量在D1和D2时期均无显著差异，发育至D3时期时单糖含量显著升高(F=309.16，df=2，P=0.0003)；豆天蛾体内的可溶性蛋白含量在3个不同滞育时期均存在极显著差异(F=1078.46，df=2，P=0.0001)，在D1时期最高，达到31.25 mg/g，显著高于D2时期的15.95 mg/g和D3时期的11.63 mg/g。说明豆天蛾滞育进程改变会引起其体内糖原、单糖和可溶性蛋白含量发生变化。

同一指标柱形图上方不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

2.2 豆天蛾滞育期间体内脂肪酸含量变化

由表1可知，豆天蛾幼虫体内不同脂肪酸含量存在一定差异，9,12,15-十八碳三烯酸(亚麻酸)、9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)和十六烷酸(棕榈酸)含量较高，其中亚麻酸含量高达14 476.04 μg/g，十二烷酸(月桂酸)和十四烷酸(豆蔻酸)含量最低，仅为0.17和1.34 μg/g。此外，随着滞育进程推进，豆天蛾体内各种脂肪酸含量均有不同程度变化，表现为先缓慢降低后急剧升高的趋势，D3时期均达到最高值，相比D2时期含量均提高10倍以上，其中棕榈酸和豆蔻酸含量增长速率最快，分别提高164.7和118.9倍。D1和D2时期，豆天蛾体内亚麻酸和亚油酸含量相对较高，分别达到930.58、736.01和380.94、312.16 μg/g；D3时期，豆天蛾体内亚麻酸和棕榈酸含量较高。说明豆天蛾滞育状态解除后，体内代谢活动逐渐增加，各种脂肪酸含量明显升高。

表1 豆天蛾滞育期间体内脂肪酸含量

进一步分析滞育前后豆天蛾幼虫体内不同类型脂肪酸含量(表2)发现，滞育前期、滞育中期和滞育解除后3个时期豆天蛾体内不饱和脂肪酸含量明显高于饱和脂肪酸含量。滞育前期(D1)，豆天蛾体内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占总脂肪酸的9.12%和90.88%；滞育中期(D2)，豆天蛾体内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占总脂肪酸的12.80%和87.20%；滞育解除后(D3)，豆天蛾体内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占总脂肪酸的37.97%和62.03%。随着滞育进程推进，豆天蛾体内饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸及总脂肪酸含量均呈“V”形变化趋势，在D2时期降到最低，但与D1时期并无显著差异，发育至D3时期后，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和总脂肪酸含量均显著提高(F=4131.01，df=2，P=0.0001；F=829.99，df=2，P=0.0001和F=1358.44，df=2，P=0.0001)。说明豆天蛾处于不同的滞育状态，体内脂肪酸含量会发生一定变化。

表2 豆天蛾滞育期间不同类型脂肪酸含量变化

2.3 豆天蛾滞育期间体内滞育激素水平变化

从图2可以看出，不同滞育时期，豆天蛾体内保幼激素(JH)和蜕皮激素(MH)水平变化趋势不同。在D1时期，JH滴度较高，在D2和D3时期，MH滴度均高于JH。2种激素水平间差异在不同滞育时期表现为D2>D3>D1。随着滞育进程推进，豆天蛾体内JH和MH 2种滞育激素水平发生不同程度的变化，其中JH滴度逐渐降低，并在D3时期出现显著下降(F=159.21，df=2，P=0.0009)；豆天蛾体内MH滴度则表现出先升高后降低的趋势，在D2时期达到最大值，为4.23 ng/mL，3个不同滞育时期MH滴度存在显著差异(F=35.38，df=2，P=0.0082)，说明豆天蛾滞育状态的变化会引起体内滞育相关激素水平发生变化。

同一指标折线图上方不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。JH.保幼激素；MH.蜕皮激素。

3 讨 论

昆虫滞育状态和非滞育状态下，体内营养物质积累会产生一定变化[19]。研究发现，滞育和非滞育丽草蛉的物质积累存在较大差异，滞育预蛹的蛋白质、脂类、甘油三酯、糖原等能源物质以及甘油、海藻糖等低温保护物质积累较多，有利于增强丽草蛉的抗逆性[11]。孙良振等[20]研究表明，一化性和二化性柞蚕在滞育解除过程中，滞育蛹的海藻糖含量无明显变化；糖原变化趋势在一化性和二化性柞蚕间存在一定差异，其中一化性柞蚕糖原含量先降低后升高，二化性柞蚕糖原含量则不断下降。吴有芳等[21]认为，随着滞育进程推进，九香虫体内脂肪含量逐渐降低，糖类和蛋白质含量均先升高后降低。本试验中，豆天蛾滞育期间体内可溶性蛋白、糖原、单糖和脂肪酸含量不断变化，随着滞育进程推进，从滞育前期到滞育期，豆天蛾体内各营养物质均减少，说明豆天蛾在滞育前期就已经取食充足的食物以维持滞育期间的代谢，还能作为冷冻保护物质，保证滞育虫体在低温下的存活。从滞育前期到完全进入滞育状态，豆天蛾还存在微弱的生命活动，因此体内的营养物质被逐渐消耗。当滞育解除后，豆天蛾体内可溶性蛋白、单糖和脂肪酸含量急剧升高，其中棕榈酸和豆蔻酸含量增长速率最快，该时期亚麻酸和棕榈酸含量最高，说明在豆天蛾滞育解除过程中，体内代谢活动增加，可溶性蛋白含量增多，糖原不断分解为单糖，同时脂肪酸被大量合成，用于豆天蛾滞育解除后的生命活动的能量来源，为豆天蛾顺利进入下个虫态奠定良好基础，这与前人的研究结果基本一致[5]。

昆虫在滞育期间体内滞育激素水平也会发生变化[22]，其中保幼激素和蜕皮激素作为重要的滞育激素共同参与调控昆虫的变态发育过程[23]。刘梦姚[24]研究表明，保幼激素JH能够促进昆虫生殖系统的发育和卵黄原蛋白的合成，进而调控昆虫滞育。本研究中，豆天蛾不同滞育时期体内JH和MH水平不断变化，随着豆天蛾滞育进程的推进，体内JH滴度不断降低，使豆天蛾在滞育终止后能够完成蜕皮化蛹，这与Belles等[25]研究结果基本一致。从滞育前期至滞育期，豆天蛾体内MH滴度不断升高，说明在此阶段豆天蛾通过提高MH水平并积累到最高值，提前为豆天蛾滞育解除后完成蜕皮化蛹奠定基础；而在滞育解除后，MH滴度逐渐降低，在老熟幼虫化蛹前出现一个高峰。本研究中，在豆天蛾滞育解除过程中，MH滴度始终高于JH滴度，说明在此阶段MH发挥了较大作用，进而诱导豆天蛾蜕皮化蛹。以上结果均表明，JH和MH直接参与了豆天蛾滞育解除后的变态发育过程。

本研究中豆天蛾滞育前后体内主要营养物质含量和激素水平与其他昆虫[26]存在较大差异，说明不同昆虫种类和不同滞育虫态，其滞育期间体内物质含量与激素调节机制不尽一致，初步认为与昆虫遗传背景和相关调控机制有关。本研究初步分析了豆天蛾滞育前后体内主要营养物质含量及滞育相关激素水平的差异，但在滞育激素如何参与豆天蛾滞育发生和解除过程，并调控体内物质合成途径等方面未进行深入探究，下一步拟在滞育不同时期对豆天蛾幼虫施加外源激素，观察豆天蛾滞育解除情况，并深入分析营养物质及激素相关酶在豆天蛾滞育过程中的功能，探明豆天蛾滞育的生理机制。

4 结 论

在豆天蛾滞育形成过程中，体内营养物质不断被消耗，蜕皮激素大量增加，同时保幼激素合成减少，为豆天蛾解除滞育提供依据；滞育解除后，豆天蛾生命活动开始逐渐增加，体内单糖、可溶性蛋白、脂肪酸等营养物质含量也随之升高，滞育激素水平有所降低，但蜕皮激素始终维持在较高水平，保证豆天蛾完成蜕皮，顺利进入下一个虫态。说明豆天蛾在滞育活动中，体内滞育激素参与了豆天蛾的滞育活动，尤其是蜕皮激素发挥了较大作用，调节了体内营养物质的合成，进而改变营养物质的含量。本研究结果为深入研究豆天蛾滞育机制及其产业发展奠定了一定的理论基础。