丹参萌发期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

张红瑞，张丽欣，李梦荷,2，何立威，杨丹丹，高致明

(1.河南农业大学农学院,河南 郑州 450046；2.新乡市农业科学院,河南 新乡 453000；3.河南省农业科学院长垣分院，河南 长垣 453400)

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草属植物，其干燥根及根茎为我国常用的大宗药材[1]，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效[2-3]。萌发期是丹参整个生育期的第一个关键阶段，直接影响其以后的生长发育与产量形成[4-6]。目前河南地区多采用育苗移栽的方式种植丹参，通常在第1年3—10月间播种育苗，10—11月初或第2年春季移栽。春播时，刚出土幼苗生长能力差，春季气温升高、光照增强，土壤容易失水；秋播时气温降低，雨水减少，常造成死苗[7]；夏播时，气候炎热、地表温度高，受干旱影响而导致出苗率低、幼苗生长缓慢[8]，因此干旱是目前该地区丹参栽培面临的主要问题之一。已有研究表明，适宜浓度的引发剂引发种子[7-8]和种子包衣[9]能提高丹参的发芽率及其抗旱性。选育萌发期抗旱性强的丹参种质，鉴定其抗旱性是提高河南地区丹参产量和质量的有效途径之一。

目前，国内外关于玉米、大麦、小麦、水稻等[10-13]作物的抗旱性鉴定和指标筛选报道较多，而关于丹参的抗旱性研究相对较少。不同栽培类型因其遗传背景、育种目标及栽培方式的不同，抗旱性表现各异。因此，鉴定丹参种质的抗旱性，筛选抗旱指标，培育抗旱品种非常必要。种子萌发期是植物生命史中最为重要的阶段，是对外界渗透胁迫响应比较敏感的时期，逆境条件下植物在这一时期的表现对农艺性状及产量具有决定性的作用，是进行抗旱性研究的重要时期[14]，且在这一时期进行抗旱性研究具有省时、容量大、环境因素影响小等优点。因此本研究采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟不同程度的干旱胁迫，研究丹参发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长、子叶长、子叶宽、十芽重等指标对干旱胁迫的响应，并通过主成分分析、相关性分析和隶属函数分析等综合分析方法明确不同丹参栽培类型的抗旱性，筛选丹参萌发期抗旱指标，为丹参抗旱性评价体系的建立及抗旱性育种奠定基础。

1 试验设计

1.1 试验材料

供试5份材料为课题组从前期收集的丹参野生种质资源中筛选获得(表1)。各类型间性状差异明显、性状稳定、整齐度高，适宜在河南省洛阳、南阳、三门峡等地区及类似生态类型区域种植。根段繁殖扩繁后收集种子，选用色泽一致、外观均一、籽粒饱满、无病虫害的5个丹参栽培类型健康种子为供试材料。

表1 试验材料Table 1 Tested material

1.2 PEG溶液配制

参照原小燕等[15]的配制方法分别将30、60、90、120 g PEG-6000溶解在1 000 mL蒸馏水中，即得到 3%、6%、9%、12%的PEG-6000溶液。本次萌发试验PEG-6000胁迫浓度设置及材料选择，均在前期预试验基础上进行。预试验内容如下：PEG-6000胁迫浓度为5%、10%、15%、20%、25%，基于丹参出苗率得出PEG-6000适宜胁迫浓度范围为0%～15%。

1.3 试验设计

挑选大小一致、种粒饱满、外表完整的5种栽培类型丹参种子各150粒(3次重复，每次重复50粒)，用1%高锰酸钾溶液消毒，蒸馏水冲洗干净置于直径为10 cm的培养皿中，培养皿底层平铺双层滤纸作为发芽床。分别加入10 mL蒸馏水、3 g·mL-1的PEG-6000溶液、6 g·mL-1的PEG-6000溶液、9 g·mL-1的PEG-6000溶液、12 g·mL-1的PEG-6000溶液，形成PEG-6000浓度分别为0%、3%、6%、9%、12%的5个处理，25℃恒温培养。从种子置床之日起开始观察，以胚根突破种皮1 mm、胚芽为种子长1/2为发芽标准，定时记录发芽的丹参种子数，记录时长为10d。

1.4 调查项目

1.4.1 种子发芽率 种子置床后第10 天取出培养皿，调查参试材料各处理每个重复的发芽数，并计算发芽率。

发芽率(%)=第10天发芽种子数/供试种子数×100%

1.4.2 种子发芽势 种子置床后第5天取出培养皿，调查参试材料各处理每个重复的发芽数，并计算发芽势。

发芽势(%)=第5天发芽种子数/供试种子数×100%

1.4.3 胚根长、胚芽长、子叶长、子叶宽 各材料种子置床后第10天，各处理每个重复随机取30粒发芽种子测定胚根长、胚芽长、子叶长及子叶宽，求其平均值。

1.4.4 十芽重 种子置床后第10天参试材料各处理每个重复随机选取10株幼苗，用万分之一天平称量其芽鲜重，求其平均值[16]。

1.4.5 萌发指数、活力指数 萌发指数GI=∑(DG/DT)，DG为逐日发芽数，DT为DG对应的发芽天数(d)；活力指数VI=GI×最后1天测的胚根长[17]。

1.4.6 隶属函数法对参试材料抗旱性评估 以抗旱相关生理及形态指标测定结果为依据，参照郝小琴等[18]的隶属函数分析法对丹参5个栽培类型的抗旱相关指标的加权平均隶属函数值进行计算，并分别综合评价各品种的抗旱性。隶属函数分析中涉及的相关参数的计算参照下式：

相对值(抗旱系数)=测定值/对照值

标准差系数：

权重系数：

2 结果与分析

2.1 丹参不同栽培类型各指标对PEG胁迫的响应

由表2可知，PEG模拟干旱胁迫处理后，不同栽培类型丹参萌发期的生长发育指标发生了一系列的变化。B和C的发芽率、发芽势随着胁迫浓度的增加表现为先升高后降低再升高的双峰趋势，而其他3个栽培类型的发芽势均表现为随PEG浓度增加呈先升高再降低趋势，低浓度(3%PEG-6000)处理促进作用最大，高浓度(12% PEG-6000)产生抑制；A、E发芽率与其发芽势变化趋势相同，而D的发芽率则表现为随着胁迫浓度增大而逐渐减小的趋势。5个丹参栽培类型中D在PEG-6000浓度为0%、3%、6%时发芽率均高于相同浓度处理下的其他材料，最高可达56.5%，C、D和E在12% PEG-6000下发芽率最低，仅为0%。低浓度(3%PEG-6000)处理对丹参种子的发芽及生长发育具有促进作用，但浓度过高(12% PEG-6000)会抑制丹参种子的萌发。随着干旱胁迫程度的增大，除D外其他栽培类型发芽势、发芽率表现出先增大后减小的趋势，5个丹参栽培类型中除E 外子叶长和子叶宽也均表现出先增大后减小的趋势，除A和D外其他类型的十芽重、萌发指数和活力指数均表现出先增大后减小的趋势。各类型材料不同的指标对干旱胁迫的反映表现趋势不一致，敏感程度也不同，用单一指标值进行抗旱性评价虽然简单易行但具有片面性，故需运用多个指标进行抗旱性综合评价。

表2 不同干旱胁迫处理下丹参的主要形态指标Table 2 Main morphological growth indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

5个丹参栽培类型在PEG-6000溶液的浓度达到12%时，种子萌发受到明显抑制，其中C、D、E种子没有萌发。9% PEG-6000浓度比6% PEG-6000浓度对A、B、D和E的胚芽长、胚根长、子叶长、子叶宽的伤害率高，对A、D和E的萌发指数和活力指数伤害率也较高。因此，9% PEG-6000是较适宜的丹参种子萌发期抗旱性鉴定浓度。

2.2 利用主成分分析及相关性分析筛选抗旱鉴定指标

对9个指标的相对值(表3)进行主成分分析(表4)，结果表明，第1和第2主成分累积贡献率达82.635%，表明前2个主成分概括了5个丹参栽培类型的9个指标82.635%的数据信息。因此，提取出前2个主成分。第1主成分中，发芽势、胚芽长、子叶长、子叶宽、十芽重、活力指数有较大的特征向量；第2主成分中胚根长和萌发指数有较大的特征向量。综合2个主成分所携带的信息，可选2个主成分中8个较大的特征向量：发芽势、胚芽长、子叶长、子叶宽、十芽重、胚根长、活力指数和萌发指数来概括9个指标的大部分信息。然后对筛选出的8个综合指标的相对值进行因子分析。结果表明，前两个因子的特征根λ>1，能够充分概括绝大多数数据。提取出前2个因子，将具有相同本质的变量归为一类，把原来8个单项指标转换为2个新的相互独立的综合指标(公因子)。根据公因子的载荷矩阵(表5)可以发现，第1个公因子F1中子叶长、子叶宽、十芽重有较大的载荷，可初步判断第1个公因子反映的是丹参种子在PEG胁迫下子叶和胚芽的生长情况；第2个公因子F2中发芽势、萌发指数、活力指数有较大的载荷，进一步说明在PEG胁迫下，发芽相关指标是比较明显的抗旱指标。因此根据2个公因子的载荷，可将子叶长、子叶宽、十芽重等划为抗旱性主要鉴定指标，发芽势、萌发指数、活力指数等划为重要指标。

表3 不同干旱胁迫处理下丹参主要形态指标相对值Table 3 Relative values of main morphological indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

表4 主成分分析结果Table 4 Results of principal components analysis

表5 各指标因子载荷、特征根和贡献率Table 5 Factor loading, characteristic root, and contribution rate of each comprehensive index

2.3 利用隶属函数分析鉴定抗旱性

为了消除遗传背景差异和单个指标研究的局限性，本研究对9% PEG-6000胁迫下各抗旱指标相对值的隶属函数值与加权平均隶属函数值进行综合性分析。由表6可知，所测9个指标的相对值变异系数变幅为64.01%～134.39%，说明本研究选用的丹参材料类型丰富，具有较好的代表性。以标准差系数赋予权重，求得各项指标的隶属函数值和综合隶属函数值(D值)，综合值越大, 说明该栽培类型的抗旱性就越强，反之越弱。根据综合隶属函数值可得出丹参抗旱性强弱依次为E、C、B、D、A，其综合隶属函数值分别为：0.071、0.068、0.054、0.043、0.028，说明E和C抗旱能力相对较强，A的抗旱能力相对较弱。

3 讨 论

萌发期是植物生长发育的起始阶段，植物在这一时期最容易受到各种逆境胁迫，逆境胁迫通过影响出苗率和成苗率决定了全田基本苗数，最终影响产量构成。所以在萌发期鉴定品种抗旱性对干旱地区的农业生产具有重要意义。植物抗旱性鉴定一般采用土壤干旱和高渗溶液模拟干旱2种方法，其中聚乙二醇高渗溶液模拟干旱胁迫的方法简单、可重复、稳定，适合在萌发期快速鉴定大量品种(系)的抗旱性，目前已成为对很多植物种子在萌发期进行抗旱性研究的重要手段。本研究采用5个浓度的PEG-6000溶液对丹参萌发期抗旱性进行分析，根据发芽率和对各种指标的伤害率情况将9%作为丹参萌发期抗旱性鉴定的适宜PEG浓度。研究发现，高浓度PEG对种子萌发产生明显的抑制作用，且各指标对渗透胁迫的响应并不一致，这与安永平等[19]、赵海明等[20]、王赞等[21]、鞠乐等[11]的研究一致。12% PEG-6000下C、D和E种子发芽率为0，可能是因为丹参种子在萌发初期会快速吸水以保证萌发所需水分，过高的渗透胁迫抑制种子吸水，从而导致其无法萌发。低浓度的PEG胁迫(3%或6%)促进部分栽培类型丹参种子的萌发及胚根、胚芽、子叶生长，这与赵方媛等[22]低浓度(10%，20%)PEG-6000有利于小黑麦种子萌发，并对幼苗根与胚芽的生长有一定促进作用的研究一致，与王涛等[23]低浓度的PEG处理有利于促进丹参种子萌发和保证出苗的研究结论一致。据表6 各指标在9% PEG-6000的隶属函数值的变异系数大小可知，发芽势、子叶长、子叶宽的变异系数分别为134.39%、117.46%和133.03%，说明这3个指标对干旱胁迫反应较敏感。

表6 9% PEG-6000浓度时各抗旱相关指标隶属函数值Table 6 Membership function values of drought resistance indexes at 9% PEG-6000

鉴定作物的抗旱性除了选择合适的评价指标外，还有要有适宜的鉴定方法。隶属函数法既能消除个别指标鉴定带来的片面性，又可使所有供试材料抗旱性具有可比性。主成分分析则可以在保证原有信息不损失的前提下，将复杂的多个单项指标转化为几个综合指标。近年来主成分分析联合隶属函数法等多方法多指标相结合手段已在胡麻[24]、酒用糯高粱[25]、谷子[26]、棉花[27]等作物抗旱性鉴定中广泛运用。本研究利用主成分分析法将9个单项指标转化成2个主成分，选取其中特征向量较大的8个指标，进一步进行因子分析，选择在2个公因子上有较大载荷的6个相关指标作为抗旱鉴定指标。由于各指标之间所用单位不同，因此结合加权隶属函数法消除不同指标间单位的差异，最后根据综合隶属函数值得出供试5个丹参材料的抗旱性强弱顺序，筛选出抗旱性较强的种质E。张树林等[28]认为萌发期抗旱性鉴定的关键指标分别是芽长、发芽势和根鲜重。张立坤等[29]运用主成分分析法结合综合隶属函数法评价了燕麦的抗旱性，筛选出萌发指数、发芽指数、活力指数、鲜重、胚芽长、胚根长和发芽势等抗旱鉴定指标。不同试验筛选出的抗旱鉴定指标不同可能是因为研究材料不同。因此，依据生产实际需求，针对不同药用植物开展种子萌发期干旱胁迫的耐旱试验，筛选耐旱材料，对指导中药材生产和选育耐旱品种意义重大。

4 结 论

本试验采用隶属函数法结合主成分分析法的抗旱性综合评价方法对5个丹参栽培类型萌发期的抗旱性进行了综合性评价。确定了9% PEG-6000为丹参种子萌发期抗旱性评价的适宜浓度，以综合隶属函数值为评价指标得出5个丹参栽培类型的抗旱性为：豫丹参VE>豫丹参VC>豫丹参VB>豫丹参VD>豫丹参VA，其中豫丹参VE和豫丹参VC萌发期抗旱能力较强，可作为丹参抗旱育种和抗旱机理研究的优异种质。通过主成分分析和相关性分析筛选出了子叶长、子叶宽、十芽重、发芽势、萌发指数和活力指数作为丹参萌发期抗旱快速鉴定指标。