优良生防枯草芽孢杆菌CY1固态发酵研制生物有机肥工艺参数优化

李彬涛，韦小敏，来航线，李玉龙，王旭东

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西 杨凌 712100)

固态发酵具有能耗低、环境污染少等优点，能使微生物保持原始的自然生长状态，有利于发酵代谢产物的积累[1]。伴随着新型功能菌株的筛选鉴定及作用机制的研究，枯草芽孢杆菌以其自身绿色环保且作用效果良好的独特优势被广泛研究推广[2]。枯草芽孢杆菌CY1(BacillussubtilisCY1)能够通过分泌胞外酶等促进植物根系生长的物质，提高植物利用养分的能力，对番茄植株生长具有促进作用，同时可以通过提高植物体内防御酶活性增强植物对病原入侵的抵抗能力，兼具生物防治及促生效果[6]，可被用作固态发酵的接种剂制备功能型生物有机肥[3]。然而，目前生物有机肥的生产主要采用有益微生物与有机肥混合的方式进行，存在功能菌存活率低、产品质量不达标等问题，造成功能菌的浪费以及生产成本的增加[4]。2019年全国微生物肥料质量检测结果显示，约78%的微生物肥料因产品有效活菌数含量较低而不合格。菌种能否在基质中存活取决于其生长环境，与碳氮比、pH、含水量及生长因子密切相关[5]，然而目前此方面缺乏系统研究。因此，如何通过工艺参数优化实现功能益生菌的扩繁至关重要。

本研究通过固态发酵试验，选取前期经过筛选鉴定得到的一株生防效果较好的枯草芽孢杆菌CY1为固态发酵功能菌剂[6]，结合原料成本及产品质量，以腐熟猪粪堆肥为发酵原料，麸皮、豆粕、玉米粉为发酵辅料，有效活菌数为观测评价指标，采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡法及响应面分析，优化固态发酵工艺条件，为固态发酵制备生物有机肥提供了基础数据，对我国北方地区粮油副产物的综合利用和资源开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：生防枯草芽孢杆菌CY1，由西北农林科技大学资源环境学院资源环境微生物实验室分离、鉴定、保藏。

发酵原料：腐熟猪粪基质，pH 8.21，含水量11.74%，有机质含量254.71 g·kg-1，总氮含量13.40 g·kg-1。

发酵辅料：麸皮、豆粕、玉米粉，购置于陕西省杨凌农业高新产业示范区农贸市场。其中，麸皮pH 9.30，含水量1.32%，有机质含量407.28 g·kg-1，总氮含量27.66 g·kg-1；豆粕pH 4.95，含水量1.95%，有机质含量448.80 g·kg-1，总氮含量81.21 g·kg-1；米粉pH 8.79，含水量2.12%，有机质含量404.26 g·kg-1，总氮含量55.37 g·kg-1。

种子培养基(LA液体培养基)：蛋白胨10 g·L-1，氯化钠5 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，pH 7.2，121℃灭菌30 min。

固体活化培养基(LA固体培养基)：在LA液体培养基中加入15 g·L-1琼脂粉。

1.2 试验设计

1.2.1 单因素试验 选取发酵辅料配比、原料辅料配比、接种量3个因素进行固态发酵试验。辅料配比设置14∶1∶5、15∶1∶4、16∶1∶3、17∶1∶2、18∶1∶1共5个水平，原料辅料配比设置7∶3、8∶2、9∶1共3个水平，接种量设置1%、5%、10%、15%(mL·g-1)共4个水平，每个处理3个重复。调节初始含水量为30%，在37℃条件下培养7 d，分别取第3天及第7天样测定CY1有效活菌数。

1.2.2 Plackett-Burman试验 根据前期单因素试验结果，采用PB试验设计(A：初始pH；B：KH2PO4含量；C：MgSO4含量；D：空列项；E：MnSO4含量；F：发酵温度；G：空列项；H：葡萄糖含量；I：(NH4)2SO4含量；J：空列项；K：含水量)，选取8个影响活菌数的主要因素，每个因素取高、低2个水平，其余3个因素为虚拟变量，用于误差估计(表1)[7]。

表1 Plackett-Burman试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.3 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验及方差分析结果，筛选主要影响因素设计爬坡方向和步长，确定最陡上升路径[8]。以活菌数为评价指标，确定最大响应区域，其余不显著因素取中间值。

1.2.4 响应面(RSM)试验 根据最陡爬坡试验结果，采用Box-benhnken试验设计，显著因素的零水平取上述得到的中心点数值，高水平和低水平分别高于或低于零水平1个实际步长[9]。以初始pH、发酵温度以及含水量为自变量，枯草芽孢杆菌活菌数量为响应值进行三因素三水平的响应面试验，并对结果进行验证。

1.3 研究方法

1.3.1 种子液的制备 将菌株CY1在固体活化培养基平板上于37℃培养箱中活化36 h，挑取单菌落接种于种子培养基，37℃、180 r·min-1培养20 h作为种子液，有效活菌数约为1.0×108CFU·mL-1。

1.3.2 活菌计数方法 称取5 g发酵原料于含有45 mL无菌水的三角瓶中，加入适量小玻璃珠，30℃、180 r·min-1振荡30 min，制得1∶10稀释液。吸取1 mL稀释液注入含有9 mL无菌水的离心管中，振荡混匀，得到1∶100稀释液。依次类推制成不同梯度10倍递增稀释液。采用涂布法进行接种，37℃恒温培养箱中培养36 h后取出计有效活菌数(CFU·g-1，干重)[10-11]。

1.4 数据处理

每个处理重复3次，结果取其平均值表示。采用SPSS 20.0进行方差分析，采用Design Expert 9.0.2软件进行Plackett-Burman试验及响应曲面试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素条件下有效活菌数的变化特征

根据发酵辅料碳氮比，设置5个麸皮、豆粕、玉米粉配比水平进行单因素试验(图1A)。第3天时，各配比之间没有显著性差异。第7天时，随着麸皮添加量的增大，有效活菌数先增加后下降，主要原因是麸皮具有更高的孔隙度，为微生物的生长繁殖提供充足的氧气，当辅料配比达到15∶1∶4这个阈值时，碳源作为主要的影响因素，粒径较小的玉米粉更有利于微生物的分解利用。因此，确定发酵辅料的配比为15∶1∶4。

以腐熟猪粪为发酵原料，麸皮、豆粕、玉米粉为发酵辅料，通过单因素试验获得最佳原料、辅料配比(图1B)。第3天时，不同处理间存在显著性差异，随着原料添加量的增加，有效活菌数逐渐下降。第7天时，原料∶辅料为8∶2的条件下活菌数达到7.8×109CFU·g-1，显著高于其他处理。因此，确定发酵原料辅料配比为8∶2。

接种量作为发酵的重要因素直接影响着发酵产物的有效活菌数(图1C)。处理间在第3天和第7天均存在显著性差异，有效活菌数随着接种量的增加而增加。与第3天相比，第7天的有效活菌数在1%、5%、10%和15%的接种量下分别提高了10.88、12.10、11.42倍及9.05倍。然而，更大的接种量意味着更高昂的生产成本，因此，确定固态发酵初始接种量为5%。

注：小写字母表示在同一时间下不同处理的差异显著性(P<0.05)。Note: Lower case letters indicate the significant difference between treatments at the same time (P<0.05).图1 固态发酵单因素试验结果Fig.1 Single factor test results of solid fermentation

2.2 有效活菌数关键影响因素的确定

如表2、表3 Plackett-Burman试验结果及方差分析所示， KH2PO4含量、MgSO4含量、MnSO4含量、发酵温度、葡萄糖含量及含水量对有效活菌数的影响效应值为正；初始pH及(NH4)2SO4含量对有效活菌数的影响效应值为负。主效应P=0.0453(P<0.05)、R2为0.9621，表明该回归模型显著，PB试验设计因素在所选取的水平范围内对发酵产物有效活菌数的影响较显著，其中，初始pH、发酵温度、含水量可信度大于95%(P<0.05)，是影响有效活菌数的显著因素。

表2 Plackett-Burman试验结果Table 2 Results of Plackett-Burman experiment design

表3 Plackett-Burman试验方差分析Table 3 Results of variance analysis of Plackett-Burman experiment

2.3 有效活菌数对关键影响因素的响应及模型的构建

根据Plackett-Burman试验结果，对初始pH、发酵温度、含水量3个显著因素进行最陡爬坡试验，其余因素取中间值(表4)。结果表明，初始pH为7.5、发酵温度为36℃、含水量为26%时有效活菌数最大，达到3.91×1010CFU·g-1。

表4 最陡爬坡试验设计与结果Table 4 Results of steepest ascent test

根据最陡爬坡试验确定的中心点，以初始pH(A)、发酵温度(B)、含水量(C)为自变量，活菌数(Y)为响应值，采用Box-benhnken中心组合设计试验(表5)，通过方差分析统计检验确定最优组合(表6)。经过回归拟合后，得到回归方程：

表5 Box-benhnken试验结果Table 5 Results of Box-benhnken experiment design

Y=4.66+0.0637A+0.1375B+0.2012C+0.1625AB-0.2500AC-0.3325BC-1.09A2-0.8885B2-0.5610C2

各因素对有效活菌数(Y)影响的顺序为含水量>发酵温度>初始pH。由表6可得，方程模型回归拟合显著(P<0.001)，失拟项不显著(P>0.05)，其中，一次项C显著、二次项A2、B2、C2极显著、交互项BC显著。该二次多项回归方程决定系数R2为0.9681，表明自变量与因变量具有较强的线性关系，该方程较好地描述了各因素与响应值之间的真实关系，可用于确定固态发酵最佳工艺条件。

表6 Box-benhnken试验方差分析Table 6 The results of variance analysis of Box-benhnken experiment

2.4 响应面分析

由图2可得，有效活菌数随着初始pH、发酵温度及含水量的增大均呈现先增大后减少的趋势，该响应曲面存在最优范围。当固态发酵条件为初始pH 7.507、发酵温度36.097℃、含水量26.325%时，有效活菌数检出量最大，预测值为4.682×1010CFU·g-1。在初始pH 7.51、发酵温度36.10℃、含水量26.33%的最佳发酵条件调整值下实际菌体数量为4.57×1010CFU·g-1，实测值与预测值接近。此外，响应值与预测值的相对误差为2.45%，在可允许误差5%的范围之内，证实了该模型的有效性。因此，该响应模型对于固态发酵条件优化可行，此试验方法具有较高的准确性，通过该方法，可获得具有较高有效活菌数的固态发酵产物。

图2 初始pH、发酵温度、含水量交互影响有效活菌数的响应面Fig.2 Initial pH, fermentation temperature and water content interacted on the response surface of effective viable bacteria count

3 讨 论

近年来随着枯草芽孢杆菌功能的研究，其作为广谱性的优良菌种得到越来越广泛的应用[12]，常常被当作有益微生物添加剂制备生物有机肥[13-14]。孙一凡等[6]研究发现枯草芽孢杆菌CY1具有促进番茄生长、增强植株抗病性的能力，是一株良好的生防菌种。本研究在此基础上，以该生防枯草芽孢杆菌CY1为接种菌剂，通过固态发酵工艺优化，旨在研制出一种具有生防作用的新型生物有机肥。

采用固态发酵的方法，在经过腐熟的有机物料中加入功能菌制备生物有机肥可有效减小土著杂菌对功能菌的影响[15]。碳氮比是影响固态发酵的一个关键因素，碳氮比过高时微生物由于氮不足生长会受到限制，碳氮比过低时发酵过程容易产生氨，过量的氨会抑制微生物的生长。本研究结果表明发酵原料、辅料质量比为8∶2，其中辅料麸皮、豆粕、玉米粉的质量比为15∶1∶4时有效活菌数含量最大。根据原料基础理化性质，该条件下碳氮比约为19。大量研究对有机物料高温堆肥的条件进行了探讨，并得到了与之相似的结论，认为碳氮比为20～30[16]、pH为5.5～8.0[17]时有利于微生物菌剂促进有机物料的分解，提高堆肥腐熟度。因此，该营养条件有利于发酵功能菌的扩繁及生物有机肥有效活菌数的提高。接种量是影响固态发酵的另一个关键参数，接种量大可以有效提高菌体的繁殖速度，然而过大的接种量会造成菌种资源的浪费，接种量太小则会使发酵周期延长，增大污染风险。因此，探索并且掌握适宜的接种量是保证发酵效果的关键因素。本研究发现，固态发酵初始接种量为5%时菌种的扩繁效率最高，且发酵产物有效活菌数含量较高、成本较低。

本研究中PB试验结果表明温度、pH、含水量显著影响固态发酵产品质量；主要是由于在微生物的生长过程中，蛋白质的合成酶、细胞的活性以及代谢产物的合成对温度敏感[18]。此外，不同微生物本身的固有特性不同，生长发育对环境pH的要求也不同。本研究与前人的研究结果一致，即细菌在中性条件下生长较好[19]。黄小琴等[20]研究表明，麸皮、豆粕等比例混合为最佳发酵基质，添加5%蔗糖及5%酵母粉，在pH值7.5、发酵温度32℃下枯草芽孢杆菌Bs2004菌株固态发酵产物含菌量达到9.62×109CFU·g-1。本研究通过工艺条件优化后，在初始pH 7.51、发酵温度36.10℃、含水量26.33%时，有效活菌数可达到4.57×1010CFU·g-1。

4 结 论

本研究在单因素试验的基础上，采用响应面分析的方法优化固态发酵工艺，优化后的最佳工艺参数为：初始pH 7.51、KH2PO4含量0.75%、MgSO4含量0.15%、MnSO4含量0.15%、发酵温度36.10℃、葡萄糖含量6.00%、(NH4)2SO4含量0.75%、含水量26.33%，此时固态发酵产物有效活菌数最大，为4.57×1010CFU·g-1。该结果为提高粮油加工副产物麸皮、豆粕、玉米粉的附加值，制备高效、廉价的枯草芽孢杆菌生物有机肥提供参考依据。