幼鼠睾丸扭转对成年期健侧睾丸及性激素影响

李刚龙 马洪 林金凤 陈进 张中严 赵鹏 刘红

(1.遵义医科大学附属医院小儿外科，贵州 遵义 563003；2.广东省妇幼保健院，广东 广州 510010)

睾丸扭转系泌尿外科常见阴囊急症，以小儿和青少年多见[1]。睾丸扭转后精索动静脉血液循环障碍，发生睾丸缺血、细胞凋亡坏死等病理改变[2-3]。国内外学者对儿童睾丸扭转研究，主要集中于短期患侧睾丸方面如扭转睾丸分子生物学变化。儿童期睾丸扭转后，对健侧睾丸生殖功能影响鲜有报道。目前一侧睾丸扭转、对侧睾丸受损仍存争议。本研究采用Turner法制作鼠性成熟前期睾丸扭转模型(扭转未坏死睾丸、扭转疑似坏死睾丸、扭转坏死睾丸)，分别采用复位和切除两种术式，待性成熟期检查健侧睾丸组织结构和性激素(FSH、LH、T)水平，以了解健侧睾丸功能。从而为临床上儿童期睾丸扭转正确处理，提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物、分组及饲养环境：选用SPF级3周龄雄性SD鼠，体重(85±15)g，由陆军军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。实验动物56只，随机分成7组，每组8只。饲养环境：实验动物放在带有气温控制和光线调节的环境[温度：(21±2℃)；湿度(50±20)%]内饲养，并可以自由觅食、饮水。

1.2实验方法

1.2.1动物模型制作 采用Turner法制作鼠性成熟前期睾丸扭转模型：实验动物给予浓度为2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，建立模型如下：假手术对照组(CG)：在无菌条件下切开阴囊左侧，游离并牵出左睾丸，不做任何处理后放回；4 h后再打开切口将睾丸用丝线固定，避免扭转，缝合切口。扭转未坏死睾丸复位组(NNTR)：左睾丸逆时针扭转90°固定4 h复位睾丸(图1A)；扭转未坏死睾丸切除组(NNTO)：左睾丸逆时针扭转90°固定4 h切除睾丸。扭转疑似坏死睾丸复位组(SNTR)：左睾丸逆时针扭转360°固定4 h复位睾丸；扭转疑似坏死睾丸切除组(SNTO)：左睾丸逆时针扭转360°固定4 h切除睾丸。扭转坏死睾丸复位组(NTR)：左睾丸逆时针扭转720°固定4 h复位睾丸(图1B)；扭转坏死睾丸切除组(NTO)：左睾丸逆时针扭转720°固定4 h切除睾丸。扭转睾丸处于不同状态判定标准如下。扭转未坏死睾丸：睾丸扭转90°固定4 h复位，睾丸色泽正常、稍水肿，针刺睾丸即刻出血；扭转疑似坏死睾丸：睾丸扭转360°固定4 h复位，睾丸呈暗褐色、水肿等表现，针刺睾丸10 min内出血；扭转坏死睾丸：睾丸扭转720°固定4 h复位，睾丸呈发黑、坏死等表现，针刺睾丸10 min后未出血。上述全部SD鼠每天注射青霉素3万U，连续1周。术后继续饲养6周，即进入鼠性成熟期。采取快速脱颈法处死SD大鼠，切取健侧睾丸并包埋制作石蜡块；同时留置心脏血液离心取血清、ELISA法检测性激素水平(卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH及睾酮T)。

注：A.正常睾丸：颜色红润、无水肿；B.扭转坏死睾丸：颜色发黑，水肿。图1 正常睾丸与扭转坏死睾丸

1.2.2性成熟期健侧睾丸组织结构变化检测 睾丸石蜡块标本连续切取厚度为3～5 μm组织切片，平铺在70℃烘片机上烘干、放入70℃恒温箱烘烤4 h；再将切片常规二甲苯脱蜡至水、梯度酒精脱水、自来水冲洗；然后苏木素染色、1%盐酸酒精分化；最后伊红染液复染、中性树脂封片，置光学显微镜观察。睾丸组织损害判定标准：睾丸生精上皮完整，各级生精细胞排列有序，无生精小管萎缩为正常；睾丸生精上皮层减少，少量生殖细胞脱落管腔中为轻度损害；生精上皮层明显减少，部分生殖细胞脱落管腔，生殖细胞排列紊乱、生精小管萎缩为睾丸组织结构损害。

1.2.3ELISA法检测性成熟期性激素(FSH、LH及T)水平变化 采用ELISA法(酶联免疫吸附测定)，即通过可溶性抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体，应用抗原抗体特异性结合特性、进行免疫反应定量和定性检测，按试剂盒说明书检测。

2 结 果

2.1性成熟期健侧睾丸组织病理学变化 CG组健侧睾丸曲细精管生精上皮完整、各级生精细胞排列有序，无生精小管萎缩(图2A)。NNTR和NNTO组：健侧睾丸曲细精管未出现病理改变，各层结构排列整齐(图2B、2C)。SNTR和SNTO组：生精上皮层减少、少量生殖细胞脱落管腔(图2D、2E)。NTR和NTO组：前者生精上皮层明显减少、排列紊乱，生精小管萎缩(图2F)；后者未出现组织结构改变(图2G)，提示性成熟前期切除扭转坏死睾丸能减轻成年期健侧睾丸损伤。

注：A.曲细精管生精上皮完整、无脱落，生精细胞排列有序，层次分明(由外至内依次为精原细胞、精母细胞、精子细胞、精子)，无生精小管萎缩。B、C.睾丸曲细精管未出现组织结构改变，各层结构排列整齐。D、E.生精上皮层减少、排列不清，细胞肿胀、成熟精子少。F、G.前者生精上皮明显减少、排列紊乱，成熟精子极少；后者未出现明显的组织结构改变。图2 各组大鼠健侧睾丸组织组织结构变化(HE×400)

2.2性成熟期性激素水平变化 采用ELISA法检测性激素(FSH、LH、T)水平见表1。FSH、LH在各组升高，T降低，但各性激素在NNTR与NNTO组间比较、以及SNTR与SNTO组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；性激素在NTR与NTO组间比较，NTR组FSH、LH明显高于NTO组，T显著低于NTO组(P<0.05)。假手术对照CG组性激素分别与NNTR、NNTO以及NTO组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；与CG组比较，SNTR、SNTO以及NTR组LH、FSH显著升高，T显著降低(P<0.05)。

表1 不同处理方式对鼠性成熟期血清中性激素FSH、LH、T水平

3 讨 论

睾丸扭转是小儿泌尿外科多发阴囊急症、常需手术探查，且依据术中情况决定睾丸取舍，但在临床实践中，一些疑似坏死睾丸在未进行病理活检情况下，很难判断睾丸活力，而且患儿家属大多不能接受切除睾丸[4-5]。对一侧睾丸扭转后，成年期对侧睾丸生精功能是否受影响，以及切除扭转睾丸还是保留扭转睾丸、何者对生精功能影响最小？目前无统一意见。

众所周知，组织形态结构与功能密切相关，组织形态结构决定功能的改变[6-8]。在本研究中发现：假手术对照CG组健侧睾丸曲细精管生精上皮完整、无脱落，生精细胞排列有序，无生精小管萎缩；NNTR和NNTO组睾丸曲细精管结构完整、未见生精上皮脱落，未出现组织结构改变，提示扭转未坏死睾丸组，可能血睾屏障未受到破坏，无抗精子抗体产生，所以无论切除还是复位扭转睾丸，对侧睾丸均未出现损伤；SNTR和SNTO组，均发生轻度的组织结构变化，即生精上皮减少，少量生殖细胞脱落于管腔，但未见生精小管萎缩，分析原因可能是扭转疑似坏死睾丸因睾丸血液循环发生障碍，出现缺血再灌注损伤，产生抗精子抗体，但又因血流并未完全阻断，抗精子抗体可以通过血液循环到达对侧睾丸，从而引起对侧睾丸的损伤，故无论切除抑或复位扭转睾丸，对侧睾丸均出现轻微损伤；NTR和NTO组中，前者睾丸形态学发生明显变化，即生精上皮明显减少，部分生殖细胞脱落于管腔，并可见生精小管萎缩，后者未出现明显病理变化。我们推测可能原因系扭转坏死睾丸因睾丸血流循环完全阻断，睾丸出现缺血坏死前产生的抗精子抗体和过氧化物，当复位扭转睾丸后血流重新灌注，发生严重的缺血再灌注损伤，抗精子抗体、过氧化物等通过血液循环到达对侧，致使健侧睾丸受损，在性成熟期精子生成的数量、质量受到损害；而切除组因没有再灌注这一过程，抗精子抗体以及产生的过氧化物不能通过血液循环到达对侧，故对侧睾丸未受到损害。

生殖激素对雄性生殖功能具有重要作用[9]。睾酮(T)是最重要的雄激素，主要由睾丸Leydig细胞分泌，通过Sertoli细胞完成对生精过程的调控[10-12]。卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素(LH)对T有重要的调控作用，LH促进睾丸Leydig细胞增殖、合成分泌雄激素；FSH主要作用于睾丸生精细胞和支持细胞，与T共同参与维持生精过程[13-15]。本研究结果表明，假手术对照CG组性激素(FSH、LH、T)分别与NNTR、NNTO以及NTO组间比较，差异无统计学意义； 与SNTR、SNTO以及NTR组比较，FSH 、LH显著升高，T在各组中显著降低(P<0.05)。这表明性成熟前期扭转未坏死睾丸无论切除与复位，以及扭转坏死睾丸的切除，对性成熟期健侧睾丸的生精功能无损害。进一步研究发现各性激素水平(FSH、LH、T)在NNTR与NNTO组间比较、以及SNTR与SNTO间比较，差异无统计学意义；但在NTR与NTO组间比较，差异有统计学意义，且NTR组中FSH、LH明显高于NTO组，T明显低于NTO组。不难看出，扭转坏死的睾丸切除，对健侧睾丸具有保护作用，分析其原因可能是睾丸扭转后，睾丸血液循环发生障碍，血睾屏障受到破坏，睾丸出现缺血、缺氧，NO、氧自由基等增多，导致脂质过氧化产生大量活性氧(ROS)[16]；当复位扭转坏死睾丸后，血液重新灌注，产生的有害物质通过血液循环到达健侧，直接杀伤睾丸Leydig细胞，使T生成减少，并通过下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节，引起垂体分泌FSH、LH增加；而NTO组无这一病理过程，无Leydig细胞的损害，性激素分泌可以维持正常。此外，一侧睾丸切除，对侧睾丸Sertoli细胞分泌抑制素B等下降，对FSH负反馈作用减弱，促使垂体前叶分泌FSH增加，通过下丘脑-垂体-性腺轴的调控，刺激睾丸Sertoli细胞、生精细胞及Leydig细胞增殖，合成性激素增加，故性激素水平亦能维持正常水平。

综上所述，鼠性成熟前期扭转未坏死睾丸的复位与切除，对性成熟期健侧睾丸无损伤；扭转疑似坏死睾丸无论切除与复位，对性成熟期健侧睾丸均有轻微损害，应予以保留；扭转坏死睾丸的切除，对性成熟期健侧睾丸具有保护作用，应尽可能切除。