抑癌基因SPRED2在肾透明细胞癌中的表达及意义

杜江 梁国标△ 彭显月 付梓峰 乐俊钧 李泰 李浩 梁天才 杜洋 赵法亮 王远亮

(1.遵义医科大学附属医院泌尿外科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属医院甲状腺乳腺外科，贵州 遵义 563000)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌最主要的病理类型，手术切除肿瘤是ccRCC现今最主要的治疗手段。目前尚无公认的肿瘤标记物以供临床早癌筛查，约25%～30%的患者在确诊时已经发生转移，其5年生存率显著下降[1]。2019年NCCN(美国国家癌症综合网络)发布了最新的肾癌临床诊疗指南中，阿西替尼等靶向药物已被纳入晚期肾癌的一线治疗方案。在晚期肾癌靶向治疗的新时代背景下，深入肾癌的发病机制研究，寻找更优的治疗靶点对推进靶向治疗有着重要意义。在我们的前期研究中，发现SPRED2(Sprouty related proteins with an EVH 1 domain 2)在ccRCC发展过程中可能发挥抑癌作用，并具备成为新肿瘤标记物或治疗靶点的潜在可能。

1 材料与方法

1.1标本的收集与处理 本课题中的前期实验标本，选取于我院于2010年2月至2017年10月期间施行手术的患者；近期实验标本取材于手术后的新鲜组织，其中包括正常肾组织、ccRCC癌组织及癌旁组织各9例。新鲜标本组织放置于液氮保存液中，并转入-80℃冰箱内保存。实验中所纳入的样本在术后病理明确诊断为肾透明细胞癌，在近期均未接受过任何药物及放射治疗；癌旁组织取自于癌组织周围2 cm以内，且未发生坏死或癌变的组织；相对正常肾组织标本取自正常肾脏在外伤后进行肾脏切除或肾脏良性病变的患者。

1.2主要试剂 SPRED2及LC3抗体购自英国Abcam公司；SPRED2及LC3II抗体购自北京博奥公司；GAPDH抗体及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒等购自碧云天公司；全蛋白提取及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自凯基公司；免疫组化相关试剂购自北京中杉金桥公司。

1.3免疫组化检测 组织切片制备：制备4 μm厚石蜡组织切片。脱蜡、脱水：室温下，将石蜡切片置于二甲苯中浸泡，再经梯度酒精脱水后漂洗；封闭：滴加3% H2O2进行封闭处理；抗原修复：用柠檬酸钠进行抗原修复；显色及染色：先后滴加5%BSA及滴加稀释好的一抗，4℃冰箱过夜。取出恢复室温后进行漂洗，并滴加二抗后再次孵育；DAB显色；封片：脱水后用树脂进行封片，用于显微镜观察。

1.4Western-blot检测 将样本组织研磨成粉末后加入蛋白裂解液，震荡使其充分裂解后离心，收集上清液；BCA法测上清蛋白的浓度按比例混合蛋白样品与上样缓冲液后，加热使蛋白变性后冷却至室温；配胶：根据SPRED2及LC3蛋白的分子量配置10 % SDS-PAGE凝胶；电泳、切胶体及转膜：待电泳结束后，切下待检测蛋白条带，将凝胶带的PVDF膜放入甲醇中浸泡后，与滤纸层一同放入转膜液中浸泡，以恒定电流转膜；转膜结束后，将PVDF膜浸入封闭液中30 min，再用PBST洗膜，并加入稀释后的一抗，4℃冰箱过夜。加入二抗后，37℃孵育；显色、曝光后，采集图像，并对结果进行灰度分析。

1.5统计学方法 运用GraphPad Prism 7.0，对所获数据进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析；P<0.01或P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在前期实验中，通过免疫组织化学法检测SPRED2及LC3在各组织中的基本表达情况，SPRED2及LC3蛋白主要定位于细胞膜和胞浆，以细胞膜为主(见图1、2)。进一步通过Western-blot检测SPRED2在各组织中的表达含量，SPRED2在癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达水平分别为(0.52±0.24)、(0.86±0.30)及(1.47±0.55)。SPRED2在正常肾组织中的表达含量显著高于ccRCC癌旁组织及癌组织，在癌旁组织中的表达水平明显高于癌组织(见图3)；LC3在癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达水平分别为(1.34±0.40)、(0.72±0.32)及(0.33±0.12)。LC3在正常肾组织中的表达水平显著低于癌旁组织及癌组织，在癌旁组织中的表达水平明显低于癌组织(见图3)。

注：a.阴性对照;b.正常肾组织;c.癌组织;d.癌旁组织。图1 SPRED2在正常肾组织、ccRCC癌组织及癌旁组织中的表达情况(IHC，×400)

注：a.阴性对照;b.正常肾组织;c.癌组织;d.癌旁组织。图2 LC3II在正常肾组织、ccRCC癌组织及癌旁组织中的表达情况(IHC，×400)

图3 图a、c是通过Western-blot检测SPRED2在正常肾组织、ccRCC癌旁组织及癌组织中的表达情况(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；图b、d 是通过Western-blot检测LC3II在正常肾组织、ccRCC癌旁组织及癌组织中的表达情况(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.001)。

3 讨 论

据2018年全球癌症统计，肾癌新增患者例数超过40万，死亡例数超过10万，发病率及死亡率呈逐年上升趋势[2]。肾癌作为一种多基因相关肿瘤，至今发病机制未明，尚无针对病因的有效救治手段。近年，SPRED2作为的一个被新发现的抑癌蛋白受到广泛关注。它作为一类与Sprouty蛋白相关的细胞膜蛋白，能够降低Ras/ERK信号调控通路的传导活性，进而对肿瘤细胞的生长产生抑制作用；并且，能够在不抑制Ras激活的状态下，调低Raf-1的表达，从而发挥对生长因子等的负向调控功能[3-4]。SPREDs家族蛋白有三个成员，包括：SPRED1、SPRED2及SPRED3；其中，SPRED2在全身多器官中均有表达。SPRED2蛋白分子结构主要由以下三个部分组成，分别是EVH 1同源结构域，KBD结构域及Sprouty相关蛋白结合区域[3]。

目前，已有多项研究结果表明，SPRED2表达水平的高低与多种肿瘤发展进程关系紧密。例如，在肝细胞癌发展过程中，上调SPRED2表达能够提升凋亡标志蛋白caspase-3的表达水平并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[5]。K.Jiang等[6]在宫颈癌及肺癌的研究中另有新的发现，高表达的SPRED2能够激活自噬标志蛋白LC3(microtubule-associated protein light chain 3)活性，并加速其转换，促进生成更多自噬溶酶体，从而诱导肿瘤细胞自噬性死亡。在前列腺癌中，SPRED2通过阻断了ERK调控通路的磷酸化，从而阻碍前列腺癌细胞增殖及转移[7]。有研究[8]进一步发现，在BRAFV600E基因突变的人黑色素瘤细胞中，SPRED1/2通过调低Ras/PI3K/AKT通路传导活性，诱导肿瘤细胞凋亡。PI3K/AKT调控通路的主要作用是，参与血管的生成、凋亡及自噬[9-11]。还有研究[12]表明，SPRED2通过调节Rho蛋白的活性，进而对肿瘤细胞的运动和转移产生抑制。在结肠癌中，SPRED2的表达降低，能够激活MAPK通过活性，促进肿瘤转移[13]。在最新的研究中，有日本学者再次证实SPRED2通过抑制MAPK传导通路活性，从而影响肺纤维化[14]。有国内学者在结肠癌中发现，SPRED2的表达水平升高，直接影响了ERK通路活性，导致结肠癌细胞的上皮-间充质转化(EMT)受到抑制[15]，众所周知，EMT与肿瘤进展关系密切[16]。在心肌细胞的研究中发现，SPRED2的缺乏能够抑制自噬，导致心功能不全及恶性心率失常[17]。综上可见，SPRED2在不同的细胞中调控功能不同，对不同肿瘤的进展过程有着不同的负向调控分子机制，尚无相关文献报道其在ccRCC中发挥的具体作用及分子调控机制。并且，近年有学者提出，SPRED2通过调控LC3蛋白的活化，从而调节肿瘤细胞的自噬程序。因此，为进一步探讨SPRED2在ccRCC中具体发挥的生物学作用及与LC3之间存在的何种关系，我们对SPRED2及LC3在ccRCC中的表达情况进行了初步实验，通过免疫组化及Western blot检测正常肾组织、ccRCC癌组织及癌旁组织中SPRED2的表达情况。

在前期实验中，我们通过免疫组化对SPRED2及LC3II在各组织中的表达进行定位检测；在近期，通过Western blot对各组织中SPRED2及LC3的含量进行定量后发现，SPRED2在正常肾组织中的表达含量明显高于ccRCC癌旁组织及癌组织，在癌组织中的表达水平最低；而LC3在正常肾组织中的表达含量明显低于癌旁组织及癌组织，在癌旁组织中的表达含量又明显低于癌组织。SPRED2在正常肾组织中表达含量最高，可能代表该抑癌因子在正常肾组织中的基础表达含量；随着肿瘤发生进展，从癌旁组织到癌组织，其表达含量逐渐降低，随着这种保护因子被不断消耗，机体对抗癌细胞侵袭的能力也随之被削弱。由此推测，在ccRCC进展过程中，SPRED2可能发挥抑癌作用。LC3是细胞自噬发生的标志蛋白，其正常肾组织中的表达含量较低，说明在此阶段细胞自噬程序可能处于休眠状态；随着肿瘤不断进展，从癌旁组织向癌组织转变过程中，细胞内压力不断蓄积，自噬被激活，故LC3的含量逐渐升高。在ccRCC中，细胞自噬是否被激活并带来保护作用，有待进一步验证。此外，我们发现，LC3在ccRCC癌组织中的表达含量最高，而SPRED2在其中的表达含量最低，两者的表达趋势相反；说明在ccRCC进展过程中两者可能不存在协同关系，自噬通路可能并未受到SPRED2表达的影响，而细胞凋亡可能是SPRED2影响ccRCC进展的主要因素。这为我们下一步实验指引方向。