Box-Behnken设计优化乌拉草中总黄酮和总多酚的提取工艺研究

崔佰吉，王 爽，张风旗，陆德焕

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

乌拉草(CarexMeyerianaKunth，CMK)是莎草科多年生草本植物，在我国东北长白山地区分布最为丰富。研究发现乌拉草中含有丰富的纤维素[1]，是生产纤维素纳米晶体的原料[2]。乌拉草中挥发油具有良好的抑菌活性[3]；乌拉草多糖具有体外抗氧化能力[4]和免疫调节活性[5]；乌拉草还富含多种黄酮类和多酚类成分，具有抗氧化、抑制肿瘤血管生成及抗衰老的作用，但目前对这一方面的研究内容比较少。

Box-Behnken design(BBD)效应面法是种多因素非线性实验优化方法，采用多元二次回归方程拟合各因素与响应值之间的函数关系，寻求最优实验条件的一种方法，在中药成分提取和药剂领域应用广泛[6-9]。本研究采用单因素结合BBD方法进行乌拉草中总黄酮和总多酚的提取工艺研究，优选提取过程中的乙醇浓度、料液比和提取时间，为乌拉草的深度开发提供理论依据。

1 仪器与试剂

UV1800紫外分光光度仪(日本 岛津)；KQ5200DE超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(德国 赛多利斯)。

乌拉草收集自吉林省磐石市，芦丁(批号：20200718)和没食子酸(批号：20200625)购自于成都普菲德科技有限公司，其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定方法

总黄酮含量测定方法按照文献的方法，以芦丁当量表示总黄酮的含量，按照文献的方法稍加改进。

精密称取芦丁对照品9.89 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、定容，得对照品储备液。分别量取对照品储备液适量，加甲醇稀释至适宜浓度的对照品溶液(0.0989、0.1978、0.2967、0.3956、0.4945、0.5934 g/L)。

分别精密量取对照品溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.6 mL，混匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.6 mL，混匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液4 mL，混匀，放置15 min；用70%的乙醇溶液定容至刻度，混匀；紫外分光光度法在510 nm波长下测定吸光度。绘制标准曲线：Y=13.455X-0.006 9，R2=0.996 6。表明在0.098 9～0.593 4 g/L的范围内线性关系良好，可以用于乌拉草中总黄酮的含量测定。

精密量取供试品溶液1 mL置10 mL量瓶中，按照标准曲线测定方法依法操作，紫外分光光度法在510 nm波长下测定吸光度，带入标准曲线，计算总黄酮的含量。

2.2 总多酚的含量测定

总多酚含量测定方法按照文献的方法，以没食子酸当量表示总多酚的含量，按照文献的方法稍加改进。

精密称取没食子酸对照品5.17 mg置10 mL量瓶中，加适量水溶解，加30%乙醇水溶液定容至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，加水稀释至适宜的浓度，得对照品溶液(0.0517、0.1035、0.2069、0.3104、0.4138、0.5170 g/L)。

精密量取各对照品溶液1 mL至25 mL量瓶中，加入福林酚试剂2 mL混匀，加入10%碳酸钠溶液6 mL混匀，加水定容至刻度，置暗放150 min，紫外分光光度法在765 nm波长下测定吸光度。绘制标准曲线：Y=46.555X-0.043 9，R2=0.989 6。表明在0.051 7～0.517 0 g/L的范围内线性关系良好，可以用于乌拉草中总多酚的含量测定。

精密量取供试品溶液1 mL置25 mL量瓶中，按照标准曲线测定方法操作，紫外分光光度法在765 nm波长下测定吸光度，带入标准曲线，计算总多酚的含量。

2.3 单因素实验

2.3.1溶剂浓度的选择

称取2 g乌拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶20分别加入乙醇溶液，乙醇浓度分别为：40%、50%、60%、70%、80%、90%，加热回流提取，提取时间为45 min，过滤，滤液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混匀，得供试品溶液(平行实验3次)。按照“2.1、2.2”项下方法测定总黄酮及总多酚的含量。实验结果表明，不同浓度的乙醇对于总黄酮和总多酚的含量影响不大，变化趋势不明显，综合评价，选取80%乙醇溶液进行后续实验。

2.3.2料液比的选择

称取2 g乌拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40分别加入乙醇溶液，乙醇浓度分别为80%，加热回流提取，提取时间为45 min，过滤，滤液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混匀，得供试品溶液(平行实验3次)。按照“2.1、2.2”项下方法测定总黄酮及总多酚的含量。实验结果表明，料液比的变化对于总黄酮和总多酚的含量影响比较明显，随着料液比例的增加，含量逐渐增加，料液比为1∶30时趋于平衡，所以选取料液比为1∶30进入后续实验。

2.3.3提取时间的选择

称取2 g乌拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶30分别加入乙醇溶液，乙醇浓度分别为80%，加热回流提取，提取时间分别为45、60、90、120 min，过滤，滤液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混匀，得供试品溶液(设置平行实验3次)。按照“2.1、2.2”项下方法测定总黄酮及总多酚的含量。结果表明，提取时间对于结果的影响不大，45 min时结果稍低，但是与其他提取时间的含量结果没有显著性差异，综合评估后选择75 min为最佳提取时间，在响应面设计时再扩大响应范围。

2.4 响应面设计

根据单因素实验结果，综合评估后进行相应的参数优化设计，选取乙醇浓度、料液比、提取时间3因素，以总黄酮和总多酚的含量结果为考察指标，采用“2.1、2.2”项下的方法进行总黄酮及总多酚的含量测定，Design-Expert12进行响应面设计。实验设计及结果见表1，方差分析结果见表2。

表1 响应面设计及结果

表2 方差分析结果表

实验结果二项式拟合后可知，回归方程为：Y=-0.350 8A2+0.186 7B2-0.408 3C2+0.332 5A+0.101 2B+0.358 8C-0.227 5AB+0.507 5AC-0.175 0BC+4.32；F值为2.92；P值为0.1254；模型相关系数为0.8401；测量信噪比为5.25(>4)。由实验结果可以看出，模型拟合度良好，各因素跨度合理，但选取的三个因素对最终结果的影响的显著程度不明显，但可以看出因素A(乙醇浓度)、因素C(提取时间)和因素A&C三项的P值分别为0.074、0.059和0.059，说明因素A和C以及两者之间的交互作用对乌拉草有效成分提取率具有一定的影响作用。

各因素交互影响结果3D图见图1。因素对提取率的影响越明显，曲面就会越凸出，曲面越平，提取率对于因素的改变越不明显。图1可以看出A&C的交互作用对总黄酮和总多酚的提取率影响最大，这一结果与方差分析中的结果得到相互的验证。最后，根据软件的计算，预测最佳的提取方案为：乙醇浓度77.4%，料液比为1∶30，提取时间为90 min。

1 A&B 2 A&C 3 B&C

2.5 验证实验

根据响应面设计预测的最佳实验方案，结合实际调整为80%，故验证实验采用的实验条件：乙醇回流法提取，乙醇浓度80%；料液比1∶30；提取时间90 min。进行平行3次验证实验，验证结果总黄酮SD为0.09，总多酚SD为0.15，显示本方法准确，重现性好，工艺稳定。

3 讨 论

由于黄酮分子结构中多含有酚羟基结构，所以总黄酮和总多酚类的测定中具有一定的重叠效果。但在单因素和BBD过程中发现，不同因素变化对有效成分的含量影响并不显著，各种因素变化范围的增大并未引起含量的梯度变化。同时BBD结果也可看出，模型设计和各因素响应结果值显著性不明显，原因可能与乌拉草中的总黄酮和总多酚实际含量有关。基础含量不高，在实验设计的各因素最低水平下能够有效提取总黄酮和总多酚，所以水平梯度上涨后，对于最后的实验结果没有显著性影响。同时，由于乌拉草为草本植物，为了便于有效成分的提取需要对其进行粉碎处理，粉碎后的乌拉草粗粉较蓬松，加入过少的提取溶剂不能完全浸没乌拉草粉末，这可能也是各因素对含量结果响应不明显的一个因素。虽然整个实验过程中各因素对乌拉草中总黄酮和总多酚的提取效率没有显著影响，但实验明确了各个因素及交互作用的相互影响，可以为乌拉草资源的有效利用提供理论参考。

本研究采用BBD法优化了乌拉草中总黄酮和总多酚的提取工艺，最终确定了最佳的提取方法，并明确了各个因素以及各个因素之间的交互作用对其提取率的影响程度，最终确定的提取工艺稳定，重现性良好，可以用于乌拉草中总黄酮和总多酚的提取。