银杏内酯和白果内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后AQP4表达的影响

刘秀萍，申龙俊，孙巳茵，邓 方

(1.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011；2.吉林大学第一医院，吉林 长春 130031)

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI) 可发生于多种脑血管疾病过程中， 而脑水肿是缺血性脑血管病中常见的并发症之一。血-脑屏障的通透性与脑水肿密切相关[1]。星形胶质细胞的终足、细胞外基质和内皮细胞是构成血-脑屏障的结构基础。组成血-脑屏障的星形胶质细胞膜上有丰富的水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表达。AQP4是膜水通道蛋白家族的成员之一，在脑组织中广泛表达，是控制水进出脑组织的通道，在脑水肿[2]、星形细胞迁移[3]、神经炎症及缺血性脑卒中等方面均起着重要作用[4]。银杏内酯(ginkgolide，GK)是银杏叶提取物中的一类萜内酯成分，主要包括单体银杏内酯A、B、C、M、J和白果内酯(bilobalide，BB)[5]。目前银杏内酯已广泛应用于临床，然而迄今银杏内酯及其单体白果内酯在脑灌注损伤后的作用机制尚不明确，其对脑缺血后脑水肿方面鲜见文献报道。为深入探究其对急性脑缺血再灌注损伤的作用机制，本研究从血脑屏障角度，观察GK和BB对脑缺血的保护作用及对缺血侧皮层AQP4表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠，体重260～280 g，吉林大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)2013-0001。

1.2 药物与试剂

银杏内酯(四川成都百裕公司提供，批号：20130801)，白果内酯(四川成都百裕公司提供，批号：NZ130609，纯度>90%)，AQP4抗体(AB3594，Minipore)。

1.3 实验分组

将实验动物随机分为4组：假手术组(Sham组)、大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型组(MCAO组)、银杏内酯组(GK组)和白果内酯组(BB组)。后两组分别设不同干预剂量亚组，即GK2.5组(2.5 mg/kg GK腹腔内注射)、GK5组(5 mg/kg GK腹腔内注射)、GK10组(10 mg/kg GK腹腔内注射)，BB2.5组(2.5 mg/kg BB腹腔内注射)、BB5组(5 mg/kg BB腹腔内注射)和BB10组(10 mg/kg BB腹腔内注射)。模型组及GK、BB各剂量组行MCAO，假手术组不插线栓。各实验组及剂量亚组每组实验大鼠6只。剂量亚组动物于脑缺血再灌注前30 min腹腔给药，假手术组和MCAO组给予等量生理盐水。

1.4 大鼠脑缺血再灌注模型的制备

实验采用Longa线栓法制备脑缺血再灌注模型，大鼠左侧MCAO 2 h再灌注12 h。应用10%水合氯醛(35 mL/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰卧位，四肢固定，去除口腔分泌物，碘伏消毒颈部皮肤，经颈正中切口，分离颈部筋膜，沿左侧胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉，暴露颈动脉三角。手术分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)和颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，注意伴行的迷走神经，防止术中牵拉导致呼吸心跳骤停。用电凝笔电凝来源于ECA的枕动脉和甲状腺上动脉，分离ECA主干，其远心端用细线将血管结扎，使其无血流通过，在近心端靠近CCA和ECA分叉处用细线在ECA上打一松结。用稍粗缝合线暂时系紧CCA，用小动脉夹暂时夹闭ICA，在颈外动脉两条结扎线间近心端侧上方近剪一倒“V”形切口，将直径为0.26 mm赖氨酸包被的钝性鱼线线栓斜行插入，通过颈内动脉推进到大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)，插入约18～20 mm遇有阻力时为止，系紧ECA根部丝线去除CCA残留的粗缝合线。大脑中动脉闭塞2 h后行再灌注，小心拔除线栓,手术线系紧血管残端，保证MCA血流再通。Sham组仅暴露CCA、ECA及ICA，不做插线处理，余操作相同。缝合肌肉和皮肤。术前实验动物禁食一夜，术前可饮水，避免急性肠梗阻的发生，术后单笼饲养，密切关注大鼠生命体征变化。

1.5 神经功能评分、脑梗死体积测定

大鼠缺血2 h再灌注12 h后，按Zea Longa 5分制评分法对大鼠进行评分。评分标准为0分：无神经功能损伤症状；1分：对侧前爪不能完全伸展；2分：向右侧转圈；3分：向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。入组标准为：评分为1～3分，且无蛛网膜下腔出血。

大鼠脑缺血2 h再灌注12 h后，经10%水合氯醛深度麻醉后迅速取脑，去除小脑和脑干，于-20 ℃冰箱中速冻18 min，然后将脑组织放入脑槽中，沿脑组织冠状切面切成5片，随后将脑片放入2% TTC溶液中，37 ℃避光置水浴箱30 min。染色结果显示正常脑组织呈红色，梗死灶呈白色。再将脑片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，数码相机拍照，应用图像分析软件计算脑片梗死面积并计算脑梗死体积占大脑体积的百分比。

1.6 脑组织病理组织学检查

大鼠脑缺血再灌注后，用10%水合氯醛麻醉，迅速开胸，用生理盐水冲洗心脏，然后用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，置于4%多聚甲醛灌注液，4 ℃固定1周，依次行脱水、透明、浸蜡及包埋，常规HE染色封片，光镜下观察。

1.7 Western blot检测AQP4的表达

取缺血侧大脑皮层进行蛋白提取，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后行SDS-PAGE电泳、转膜封闭，加入一抗(AQP4，1∶500；β-actin，1∶2000)，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶2000)室温孵育，ECL液显色，凝胶成像系统显影。采用Image J图像分析测定Western blot条带灰度值，结果以AQP4与β-actin灰度值得比值显示。

1.8 统计学处理

实验数据以Mean±SEM表示，采用Graphpad软件对数据进行统计学分析，各组数据采用One-way ANOVA统计学分析，两组间比较应用t检验。

2 结 果

2.1 GK和BB对脑缺血再灌注大鼠脑梗死范围及神经功能缺损的影响

脑缺血2 h再灌注12 h，Sham组无神经系统损害症状，评分为0分；MCAO组均出现明显的神经功能缺陷症状，主要表现为其左侧明显的Horner’s症状，右侧前肢不能完全伸展，大鼠行走时主要右侧转圈或是右侧倾倒；GK5组、GK10组和BB5组、BB10组可明显改善大鼠神经症状(P<0.05)。提示GK和BB对大鼠神经功能损伤有改善作用。见表1。

表1 缺血2 h再灌注12 h后各组大鼠神经行为学评分及梗死体积百分比结果

2.2 HE染色组织形态学表现

Sham组未见明显病理改变，各种神经细胞层次清晰，细胞数量、形态多样化，胞核界限清晰，胞质均匀，可清晰见到细胞核。MCAO组见大鼠脑缺血中心区大量神经元变性坏死，细胞排列紊乱，形态不规则，可见部分神经元胞质浓缩，胞核固缩、碎裂或溶解。GK10和BB10组与MCAO组相比，梗死区缩小，神经元损伤程度减轻，细胞排列尚规则，残存的细胞形态相对正常，GK10组残留的神经元细胞数较BB10组稍多，但GK2.5，GK5，和BB2.5，BB5与MCAO组比较形态学有所好转，但不明显。见图1。

图1 缺血再灌注后各组大鼠HE染色结果(×400)

2.3 GK和BB对大鼠脑梗死范围的影响

大鼠脑缺血2 h再灌注12 h后，脑组织经过2% TTC染色后，正常脑组织染成红色，梗死脑组织不着色，即为白色。Sham组脑组织呈均一红色，未见梗死灶；MACO组皮层和皮层下梗死面积大，与MCAO组相比，GK5组，GK10组和BB5组，BB10组脑梗死范围明显减小(P<0.05)，且与剂量呈负相关，提示GK和BB对缺血再灌注脑损伤有保护作用(图2、表1)。

图2 缺血2h再灌注12h后各组大鼠TTC染色结果

2.4 脑缺血再灌注大鼠皮层AQP-4的表达

Western blot结果：大鼠缺血2 h再灌注12 h后，与Sham组比较，MCAO组的AQP-4表达量明显升高；与MCAO组比较，GK各亚组和BB亚组中AQP-4蛋白表达量都有所下降，其中GK10组和BB10组下降最为显著，有统计学差异，P<0.001。见图3。

与Sham组比较，###P<0.001；与MCAO组比较，***P<0.001图3 Western blot检测大鼠缺血侧皮层AQP-4蛋白的表达

3 讨 论

缺血性脑血管病约占全部脑血管病的75%，而脑水肿是缺血性脑血管病常见的病理环节之一。脑水肿的发展是分阶段的，细胞毒性水肿表现为急性损伤后数分钟，而血管源性水肿则发生在缺血性卒中损伤后数小时，主要由于血脑屏障结构破坏而引起。

近年来，水通道被认为是脑水肿与水通透有关的重要介质。已知的水通道有14个，但只有AQP 1、AQP4、AQP9和AQP11在中枢神经系统中表达。其中，AQP4是星形胶质细胞表达的主要水通道蛋白，是脑水肿形成和清除的主要参与者[6]。AQP4可介导水跨膜的双向运动,参与血浆渗透压的调节、血脑屏障的发育和功能维系,并兼有细胞外渗透压感受器的功能,对维持脑内水平衡至关重要[7]。

Aoki等[8]通过免疫组织化学双标法检测AQP4的表达，研究表明，在缺血性脑卒中发生后，AQP4在脑组织中表达水平显著升高，且在缺血中周围较中心高。王秀辉[9]等应用Werstrn Blot法检MCAO模型脑组织中的AQP4水平，结果显示，缺血侧脑组织中AQP4表达水平随时间的推移呈上升趋势，在24 h时达到最高峰，48 h时AQP4表达稍有下降。实验发现[10]，敲除AQP4基因的小鼠在脑缺血和水中毒期间，星形胶质细胞肿胀减少，脑水肿程度减轻，其神经功能缺损程度也随之变小。

银杏内酯及白果内酯是目前研究较多的银杏叶制剂中最为有效的脑保护剂。银杏内酯主要作用为抗血小板、抗炎、抗氧化、调节免疫功能、抗兴奋毒性[11]及抗细胞凋亡[12]等作用；白果内酯主要有抗炎[13]、抗兴奋毒性[14]、调节能量代谢[15]等作用。上述两种物质均易通过血脑屏障。

本研究通过制备大鼠MCAO模型并给予不同浓度银杏内酯和白果内酯进行干预，从体内实验的角度探讨银杏内酯和白果内酯可能的作用机制。实验结果表明，脑缺血再灌注过程中，AQP4蛋白水平的增高有可能引起星形胶质细胞对水的通透性增加，从而造成细胞损伤，导致大鼠出现神经功能缺损症状。银杏内酯和白果内酯可以通过显著降低缺血侧AQP4蛋白的表达，减轻脑水肿程度，保护神经元细胞，改善大鼠神经功能损害,这可能为临床预防和治疗脑水肿及脑梗死提供新的靶点。