老年甲状腺乳头状癌患者超声造影特征与BARF V600E突变的相关性

张静 李宏英 李辉

(天水市第一人民医院超声科，甘肃 天水 741000)

乳头状癌(PTC)是甲状腺癌中最常见的病理学类型，占甲状腺所有恶性肿瘤的80%～85%。目前研究〔1〕已明确，除了患者年龄、性别、局部浸润及淋巴结和远处转移外，鼠类肉瘤滤过性毒素菌致癌同源体B1(BRAF)基因V600E突变亦被证实是甲状腺PTC预后不良的危险因素。BRAF V600E突变阳性的PTC生物学行为较BRAF V600E突变阴性的PTC更为恶劣，其局部复发率和远处转移风险更大〔2〕。目前超声检查联合细针穿刺细胞学是明确甲状腺结节性质的常用手段。研究〔3〕表明，超声造影(CEUS)相较于常规超声检查更能提示结节的性质和判断其生物学行为。然而，CEUS与PTC结节BARF V600E突变的相关性尚不明确。本研究主要探讨老年PTC患者CEUS结果与BARF V600E突变的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象 纳入2018年10月至2021年10月天水市第一人民医院确诊的157例老年PTC患者。纳入标准：(1)细胞学或术后病理明确诊断为PTC；(2)首次确诊，既往无其他甲状腺疾病或手术史。排除标准：(1)年龄<60岁；(2)未行病理学检查或病理提示为其他类型甲状腺肿瘤，如滤泡状癌；(3)无相应BARF V600E突变检测结果；(4)合并其他甲状腺疾患，如甲状腺功能亢进、桥本甲状腺炎等；(5)存在严重心力衰竭或肝肾功能不全等CEUS禁忌证；(6)CEUS图像质量差或对造影剂过敏。

1.2研究方法 通过电子病历系统收集所纳入患者的临床和超声检查结果资料，包括患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤是否多灶性及是否分布于双叶。若患者存在多个PTC结节，则以行BARF V600E突变所对应的结节为准纳入分析。

患者取卧位，颈部过伸，充分暴露甲状腺后首先行常规超声检查探视每个甲状腺结节。随后使用Bracco公司超声造影剂声诺维外周静脉注射行CEUS检查，超声仪器为东芝 Aplio 400彩色多普勒超声诊断仪，探头频率 7.5～13.0 MHz。经肘静脉快速推注2 ml造影剂，随后以5 ml生理盐水冲管，立即开启储存，动态观察3 min。CEUS均由一名经验丰富的超声医师操作和解读。从常规超声和CEUS结果中提取有关结节信息，① 结节形态：规则vs 不规则；②边界：清晰 vs 不清晰；③是否为低回声；④纵横比；⑤是否有微钙化；⑥血流信号：多vs少；⑦造影后结节大小：增大 vs 无变化；⑧增强均匀度和增强程度；⑨增强方式：向心性vs弥散性；⑩增强时间：同步或快进 vs 慢进；廓清时间：同步或慢消 vs 快消。由细针穿刺细胞学或术后病理明确PTC诊断。从细针穿刺或外科手术标本中提取基因组DNA，并使用实时荧光定量PCR法进行扩增。前向和反向引物分别为5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′和5′-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3′。通过实时监测扩增反应中各循环扩增产物量，最终通过得到的Ct值及标准曲线对其进行定量分析。利用Sanger测序法明确是否存在BARF V600E突变。

1.3统计学分析 应用SPSS25.0软件进行t检验、χ2检验、多因素二元Logistic回归分析。使用受试者工作特征(ROC)曲线明确变量鉴别BRAF V600E突变与否的最佳切割值、曲线下面积(AUC)及敏感度和特异度。

2 结 果

2.1BARF 600E突变组与BARF 600E野生组临床特征比较 86例(54.78%)存在BRAF V600E突变。BRAF V600E突变组与野生组年龄、性别构成、肿瘤直径、肿瘤多灶性分布及双叶分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 BRAF V600E突变组与非突变组临床特征比较

2.2BARF 600E突变组与野生组常规超声和CEUS特征比较 同BARF V600E野生组相比，BARF V600E突变组结节纵横比≥1、微钙化、造影后结节增大、向心性增强及增强时间为同步或快进的比例均显著升高(均P<0.01)。见表2。

表2 BRAF V600E突变组与野生组常规超声和CEUS特征比较〔n(%)〕

2.3BARF V600E突变的多因素分析 纵横比≥1、微钙化及造影后结节大小增大与BRAF V600E突变率升高有关(P<0.01，P<0.001)。见表3。

表3 常规超声和CEUS特征与结节BRAF V600E突变的多因素分析结果

2.4BRAF V600E突变模型 根据表3中的回归系数，BRAF V600E突变的模型，其中纵横比≥1赋值1分，纵横比<1赋值0分，有微钙化赋值2分，无微钙化赋值0分，造影后结节增大赋值2分，造影后结节无变化赋值0分。

2.5模型效能评估 ROC曲线显示，当模型总分>2分时，该模型预测结节BRAF V600E突变的AUC为 0.83(95%CI：0.76～0.88)，敏感性为88.4%(95%CI：79.7%～94.3%)，特异性为60.6%(95%CI：48.3%～72.0%)。见图1。

图1 所构建模型预测结节 BRAF V600E突变的ROC曲线

3 讨 论

随着超声筛查的普及，我国甲状腺癌特别是微小PTC癌的发病率剧增〔4〕。普遍认为PTC临床病程惰性，预后良好，仅有极少部分患者发生远处转移和肿瘤性死亡。BRAF基因位于7号染色体，其中的V600E突变即为该基因15号外显子上第600位缬氨酸突变为谷氨酸。有研究〔5〕表明，BRAF V600E突变率为60%～70%，突变阳性的甲状腺PTC生物学行为更为恶性。

超声是评估甲状腺结节良恶性、规划手术方案及术后检测的一线检查手段。现已明确〔6〕，PTC常规超声图像特征为低回声结节，边界不清，形态多不规则，纵横比≥1，且结节内常伴微钙化。一包含31项研究、共计18 288个甲状腺结节的荟萃分析〔7〕发现目前常规超声诊断PTC的准确率可高达74%～82%。CEUS是通过静脉注射造影剂来实时、间接反映组织和器官血流分布和血流灌注特征的成像方式。超声-病理对照研究〔8〕发现，CEUS的定量参数如达峰强度、达峰时间等与肿瘤的微循环密度显著相关，而甲状腺恶性结节静脉窦密度显著高于良性结节，为CEUS评估甲状腺结节提供了坚实基础。研究〔9〕表明，CEUS鉴别甲状腺良恶性结节的敏感性为97.73%，特异性为89.47%。

目前有关超声图像特征与BRAF V600E突变间的关系尚不十分明确。本研究多因素分析中，纵横比≥1、微钙化和造影后结节增大与BRAF V600E突变关系密切。Li等〔10〕研究表明，BRAF V600E突变阳性结节声像学特征与野生型结节并无明显区别，即常规超声特征无法用于明确该基因是否突变；然而，Kabaker等〔11〕研究发现，纵横比≥1、边界不清、低回声、微钙化及无晕这5个声像特征中存在≥3个，则其对BRAF V600E突变的阳性预测率为82%，与本研究结论相类似。Lin等〔12〕研究发现，向心性增强方式和低增强是BRAF V600E突变结节的CEUS特征，但其敏感性和特异性仅为68.3%和40.0%。现有文献报道争议较大可能与研究人群种族、特征及所使用的研究方案等因素有关。

本研究显示，造影后结节增大是BRAF V600E突变在CEUS中的声像学特征。一般认为造影后结节增大反映肿瘤呈浸润性生长〔13〕。BRAF V600E突变能够增加激酶的活性，继而导致丝裂原活化蛋白激酶通路持续性活化，促进肿瘤生长和进展〔14〕。有学者利用超声弹性成像发现BRAF V600E突变的甲状腺结节硬度更高〔15〕，这可能也是突变阳性结节微钙化比例更高的原因。

本研究通过构建了评分系统来预测BRAF V600E突变的风险。ROC曲线结果提示，当纵横比≥1、微钙化和造影后结节增大3个特征中存在至少2个特征对BRAF V600E突变预测的敏感性较高，但特异性较低。本研究为单中心、回顾性研究，且仅分析了CEUS的定性主观指标，难以克服主观因素的影响，这些因素均有可能限制了模型的效能。

综上，纵横比≥1、微钙化、造影后结节增大3个特征与BRAF V600E突变相关。据此构建的模型对预测BRAF V600E突变有较高的效能。