冠心病中医证型代谢组学研究进展*

汪顺伟 荆晓朔 欧 颖 陈善达 李 静 谢梦洲 李 亮

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

大量研究表明中医学治疗冠心病疗效确切。但冠心病证型缺乏客观化标准及足够的数据支持，使中医证型本质研究难以进行。代谢组学是系统生物学的重要分支［1-3］，被广泛应用于疾病早期诊断、药学以及作用机制研究等领域［4-5］。其动态性、整体性、即时性的特点与中医学的“整体观”“辨证论治”核心理论不谋而合。本文通过代谢组学技术对冠心病证型研究进行评述，探讨冠心病各证型代谢产物差异，将中医学证型诊断与现代医学客观指标相结合，以期为冠心病不同证型客观化标准提供理论支撑，有利于更好地揭露其证候本质、指导疾病诊断及预后，发挥中医学与现代医学在冠心病诊治上的优势。

1 代谢组学技术与冠心病中医证型的关联

中医证型是发展的、变化的，包括病位、病因、病性等，能够更全面、更深刻、更准确地揭示疾病本质。而代谢组学是一门关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。二者在整体观念上高度统一，均为整体中某一阶段病理变化的本质和发展趋势的反映。

代谢组学主要技术平台包括：核磁共振技术（NMR）［6-7］、质谱（MS）［8］技术、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）［9］、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）［10］、毛细管电泳与质谱联用技术（CE/MS）、液相色谱与质谱先后使用技术（LC/MS/MS）等。其中最常用的3种技术为 NMR、LC-MS、GC-MS［11-12］。代谢组学技术通过寻找中医证型的标志代谢物，为中医理论提供数据支持的同时，也为中医的理论研究提供了新方法。

2 代谢组学技术在冠心病各证型中的应用

2.1 核磁共振技术

2.1.1 心血瘀阻证 通过NMR探讨心血瘀阻型冠心病的指纹代谢图谱，易敏等［13］研究发现冠心病心血瘀阻证患者血浆代谢物中葡萄糖、3-羟基丁酸、极低密度脂蛋白水平升高，甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、酪氨酸、甲酸盐水平下降，提示以上15种代谢物可能是冠心病血瘀证血浆标志性代谢物。王勇等［14］采用NMR研究Ameriod缩窄环对冠心病血瘀证小型猪血清代谢物的影响，发现样本中柠檬酸、葡萄糖、γ-氨基丁酸、肌酸、谷氨酸、乳酸、苏氨酸、β-羟丁酸、脯氨酸等糖类和氨基酸类代谢物的水平上升，极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量降低。说明冠心病心血瘀阻证代谢途径主要为糖、脂、氨基酸类代谢，其中柠檬酸、乳酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸等分子可能成为冠心病心血瘀阻证的临床诊断与治疗靶标。史琦等［15］使用NMR检测冠心病心血瘀阻证患者血浆样本中内源性小分子和大分子代谢产物，发现心血瘀阻证患者血浆代谢物中脂类、脂类化合物、缬氨酸、异亮氨表达水平下降，赖氨酸、肌氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、乙酰谷氨酸、苏氨酸、β-羟丁酸、天冬氨酸、肉碱、组氨酸、甲胺、丙酮、谷酰胺、低密度脂蛋白、胆碱、不饱和脂肪酸等的表达水平明显升高。表明氨基酸代谢和脂质代谢互相影响，共同作用于冠心病的发生发展，以上代谢产物可能为鉴别心血瘀阻证的重要理化指标。

2.1.2 气虚证 史琦等［16］使用NMR研究冠心病气虚证患者血浆代谢物，发现乙酰谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、肉碱、天冬氨酸、谷酰胺含量降低，色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、组氨酸、谷氨酸含量上升，其中乙酰谷氨酸、缬氨酸、肉碱、赖氨酸可能是冠心病气虚证的标志性代谢物，与糖、氨基酸、脂肪、能量代谢和氧化应激反应等相关。华何与等［17］使用NMR研究冠心病气虚证患者血浆代谢物，发现其代谢物中丙酮、柠檬酸、氧化三甲胺、3-羟基丁酸含量较高，酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、亮氨酸含量较低。通过数据对比，何华与等［17］发现NMR图谱能够有效区分气虚证与心血瘀阻证。

2.1.3 痰浊证 易敏等［18］发现冠心病痰浊证患者血浆中有16种生物潜在标志物，为丙氨酸、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、缬氨酸、乳酸、谷氨酸、丙酮酸、肌酸、谷氨酰胺、胆碱、谷氨酰胺、丙酮酸、肌酸、柠檬酸盐、组氨酸、甘氨酸、酪氨酸和甲酸盐、葡萄糖、苯丙氨酸。除胆碱和葡萄糖水平升高外，其余代谢物水平均下降。由此可见，能量代谢是冠心病痰浊证血浆代谢中的重要环节。张红栓等［19］研究冠心病痰浊证患者尿液代谢物，发现顺式-乌头酸、葡萄糖、丙酮、柠檬酸、α-酮戊二酸、3-羟基丁酸、酪氨酸、马尿酸、肌酐、二甲胺、氧化三甲胺的含量高于血瘀证组，而胆汁酸及组氨酸的含量则低于血瘀证组，其涉及能量代谢、糖代谢、脂代谢等多个方面。而血浆NMR结果［20］显示，痰浊证组存在能量代谢、氨基酸代谢紊乱以及严重脂质代谢紊乱。其特异性标志物可能为丙氨酸、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂类化合物、酮体、高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白、天门冬氨酸、异亮氨酸、谷氨酞胺、白蛋白赖氨酰、丙氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸。

2.2 色谱-质谱技术

2.2.1 心血瘀阻证 通过GC-MS，牟菲等［21］发现冠心病心血瘀阻证与假手术组大鼠血清之间的内源性代谢物差异生物标志物共14种，其中乳酸、3-羟基丁酸、硬脂酸、磷酸、十七酸、棕榈油酸、花生四烯酸水平升高，而苯丙氨酸、谷氨酰胺、苹果酸、延胡索酸、肌酸、柠檬酸及亚油酸水平降低。魏星等［22-23］采用GC-MS发现冠心病心血瘀阻证血浆的代谢标志物共23种，分别为异亮氨酸、L-丝氨酸、甲基丙二酸、L-缬氨酸、亮氨酸、L-苏氨酸、L-焦谷氨酸、花生四烯酸、丙氨酸、柠檬酸、亚油酸、油酸、甘氨酸、棕榈酸、异油酸、羟基乙酸、（9E）-9-十六烯酸、草酸、2-羟基丁酸、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖。周曼丽等［24］研究发现心血瘀阻证组与正常组大鼠心肌组织代谢物之间相比存在19种组间差异代谢物，并鉴定出苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸生物合成，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸生物合成，牛磺酸及亚牛磺酸代谢与氨酰-tRNA生物合成富集性显著，可作为研究心血瘀阻证作用机制的代谢通路。李静等［25］使用LC-MS研究发现冠心病心血瘀阻证与假手术组大鼠尿液代谢物存在36种差异，其中甘油、L-硒代蛋氨酸、尿嘧啶含量上升，N-乙酰基-L-天门冬氨酸、丙氨酰亮氨酸、D-丙氨酸、氨基葡萄糖6-磷酸、D-核糖5-磷酸、缬氨酸赖氨酸、丙氨酰谷氨酸、赖氨酰缬氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、缬氨酸、D-木酮糖、脯氨酰脯氨酸、5'-磷酸吡哆醛、4-乙酰氨基丁酸、假尿苷、D-核糖、尿酸、海藻糖、1H-吲哚-3-甲醛、5-磷酸-α-D-核糖 1-二磷酸、α-D-核糖1，2-环磷酸盐 5-磷酸盐、脱氧腺苷、泛酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、D-木糖醇、磷酸烯醇丙酮酸盐、乳糖、L-硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、5-氨基咪唑-4-羧酰胺、D-葡糖醇-1，5-内酯6-磷酸盐、磷酸甘油含量减少，其机制涉及能量代谢失衡及氨基酸代谢、糖代谢、嘌呤代谢紊乱、脂质堆积等多个方面。

2.2.2 气阴两虚证 朱明丹等［26］通过LC-MS研究发现气阴两虚证组中苯丙氨酸、磷酸肌酸、甘氨酸、高丝氨酸、葡萄糖含量较低，提示气阴两虚证可能与氨基酸代谢水平低及能量代谢异常相关。朱萱萱等［27］使用GC-MS研究发现女性患者中气阴两虚型冠心病完全能和气虚血瘀型、痰阻心脉型冠心病区分开来，但并未说明其具体差异代谢物。

2.2.3 气滞血瘀证 朱明丹等［26］应用LC-MS研究发现气滞血瘀证中葡萄糖、花生四烯酸、亚油酸显著增高。杨小芳等［28］采用LC-MS发现气滞血瘀证样本中组氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、亮氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-组氨酸较对照组含量升高，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸较对照组降低。

2.2.4 气虚血瘀证 杨小芳等［28-29］采用LC-MS发现冠心病气虚血瘀证和气滞血瘀证血清样本之间的差异物主要是瓜氨酸和组氨酸，在前者中升高更为明显。尹春园等［30］使用LC-MS研究发现气虚血瘀证证型标志物为可能为亮氨酸和异丁肉碱，代谢途径主要涉及能量代谢、脂肪酸氧化和磷酸胆碱代谢。徐利云等［31］基于LC-MS发现21个差异代谢物可能是气虚血瘀证潜在生物标志物，其中花生四烯酸、脂肪酸酰胺、维生素B6、色氨酸引起的代谢紊乱可能是导致大鼠气虚而无力推动血液运行的主要途径。通过色谱质谱联用方法，陈浩等［32］认为天冬氨酰蛋酸和半胱氨酸亚磺酸可能成为此证型的潜在生物标志物。这为冠心病中医辨证分型客观化、标准化提供了重要理论支撑。

2.2.5 痰阻心脉证 程鹏等［33］使用GC-MS区分冠心病痰阻心脉证与气虚证患者的血清代谢产物，发现了共46个化合物，其中丝氨酸和2-羟基丙酸可能成为区别该两种证型的标准代谢物。鹿小燕等［34］使用色谱质谱联用技术对比痰阻心脉证患者和心血瘀阻证患者血清代谢物，发现5-羟色胺/可替宁、溶血卵磷脂、苹果酸、琥珀酸、果糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、棕榈烯酸等在心血瘀阻证组中升高，而7，10-十六碳二烯酸和DPA在痰阻心脉证组中降低，由此可见其差异代谢物主要有果糖、葡萄糖、苹果酸、琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸以及棕榈烯酸。

2.2.6 痰瘀互结证 具星等［35］对冠心病痰瘀互结证患者血清进行LC-MS，发现其特异代谢物为6-去氢睾酮葡糖苷酸、甘氨鹅脱氧胆酸、LTE4及Corchorifatty acid A。张妮等［36］通过LC-MS发现经化瘀祛痰方治疗后40个潜在代生物标志发生改变，涉及脂类代谢、蛋白质代谢、嘌呤代谢、维生素代谢等代谢途径。李珠［37］使用LC-MS分析发现冠心病痰瘀互结证大鼠的血清样本中丹蒌片主要通过能量代谢、类固醇激素代谢、甘油磷脂代谢以及氨基酸代谢等调节17个生物标记物［甜菜碱、γ-亚麻酸、亚油酸、11，14，17-二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、LPC（16∶1）、LPC（20∶4）、LPC（22∶6）、LPC（16∶0）、LPC（18∶1）、异丁酰肉碱、19-羟基脱氧皮质酮、L-氯化棕榈酰肉碱、精氨酸、5-羟基吲哚乙醛、L-辛酰基肉碱、5-羟基色胺］，这些标记物中可能存在冠心病痰瘀互结证特异性代谢产物。采用LCMS，朱黎霞等［38］研究发现痰瘀互结证患者尿液存在13种差异代谢物，其中鞘脂类在两组中差异最为明显，其对细胞增殖、分化以及凋亡具有重要作用，能有效辨别冠心病痰瘀互结证型。

3 讨论与展望

中医学以整体观为理论核心、以辨证论治为诊疗特点。代谢组学以代谢产物为基础，研究疾病变化的动态代谢轮廓，二者十分相似。因此代谢组学能够为冠心病各证型的实质研究提供理论依据及数据支撑，对其辨证、诊断和治疗具有重要意义［39］。但检索数据库发现，使用代谢组学进行冠心病中医证候分型的研究较少，其使用技术大部分为核磁共振技术和色谱-质谱联用技术，其他技术研究极少。现有证型研究不仅缺乏动物实验研究，且临床试验样本研究也较少。需研究人员在整合现有研究成果基础上，不断拓宽研究类型、丰富研究内容，为冠心病中医辨证分型研究提供实验依据和方法。

本研究发现冠心病各证型代谢通路皆涉及氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、糖代谢等方面［40］。如心肌缺血后产生大量乳酸，激活糖异生途径，将乳酸转化为葡萄糖，伴随糖氧化障碍等使甘油三酯代谢异常，导致脂质沉积，冠状动脉粥样硬化，且过量脂肪酸进入线粒体导致氧化磷酸化解耦联［37］，使能量代谢产物消耗，进一步使线粒体功能失调从而加重冠心病的发生。因此氨基酸、能量、糖脂等各项相关代谢物可能成为评价不同证型冠心病特异性指标。所以代谢组学有望成为揭示冠心病不同“中医证型”本质的平台，能够为中医临床诊疗提供更加科学丰富的临床检测指标，但代谢组学技术还存在一些局限，首先，不同代谢组学检测手段可能产生不同研究结果，尚不能对代谢产物进行全方面定性定量分析。其次，冠心病各证型中不同课题组使用的代谢组学技术不同，其研究结果的代谢物差异较大，无法在一定程度上保持高度一致，不利于冠心病不同证型的标志代谢物的标准化制定。各实验研究中样本种类及样本量的不足对代谢组学检测结果的准确性和可靠性有较大影响。最后，研究者所依托的数据库标准未统一，在一定程度上延误了冠心病各证型代谢标志物的研究进展，造成了一定的资源浪费。因此，增加样本种类及样本量，统一生物样本采集与处理标准，加强科研人员之间的联系，充分利用现有研究资源，使用多种联合组学技术是未来代谢组学研究的关键举措。