东莨菪碱法和高渗盐水法复制小鼠干燥综合征模型的比较①

文 凤 李 清 李 萃 谷瑶红 马玉萌 郝静超

（昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，昆明 650500）

干燥综合征（Sjögren syndrome，SS）也称舍格伦综合征，是累及外分泌腺体慢性炎症的自身免疫结缔组织疾病［1］。其病理表现为大量淋巴细胞浸润外分泌腺体间质，并伴有外分泌腺体上皮细胞破坏和萎缩［2］。临床局部表现为唾液黏蛋白缺失引起的口干燥、口腔黏膜溃疡或继发感染、泪腺分泌黏蛋白减少引起眼干燥性角结膜炎等；系统性表现为全身乏力、低热，约有2/3 患者出现全身系统性损害［3］。患者血清中存在多种自身抗体。SS 分为原发性和继发性两类，仅有外分泌腺受累则称为原发性干燥综合征（pSS）；若同时伴有其他结缔组织损害或继发其他自身免疫性疾病则称为继发性干燥综合征（sSS）。SS 主要患者为中年妇女，全世界患病率为0.3‰～3‰，我国患病率为0.3%～0.7%，40 岁以上人群患病率高达3%～4%［4-5］。

SS 发病机制尚不明确，目前认为其与遗传、感染及环境等多种因素密切相关［6-7］。经自体蛋白激活免疫反应途径产生IFN，从而促进单核细胞、 T细胞、B 细胞和靶器官（如唾液腺上皮细胞）产生 B细胞活化因子BAFF，BAFF 与免疫细胞受体BAFFR 结合后继续促进B 细胞的增殖活化，进而分泌自身抗体SSA、SSB 和抗核抗体ANA［8］。活化的T 细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10 等细胞因子联合自身抗体共同作用促进疾病进程［6，9］。

动物模型是研究SS发病机制的重要辅助手段，但由于目前缺乏SS 特异性高的生物标志物和能够完全模拟临床SS 病理的动物模型，故抗SS 药物筛选研究仅能以动物干眼模型作为主要研究对象。因此选择便利的造模方法和稳定的动物模型显得非常关键。

东莨菪碱是茄科植物中的一种莨菪烷型生物碱，其主要通过阻断副交感神经传导作用于中枢和外周，竞争性拮抗毒蕈碱乙酰胆碱受体，从而发挥其镇静和抑制腺体分泌等作用。本文旨在利用东莨菪碱和高渗盐水分别诱导复制SS小鼠模型，通过观察比较小鼠体质量变化百分比、饮水量消耗情况、泪液结晶变化、外周血自身抗体SSA、SSB 和抗核抗体ANA表达量、TNF-α和BAFFR炎症因子表达量、脾脏湿重和脾脏系数、分泌腺组织中淋巴细胞浸润评分等指标比较两种方法的便利性和稳定性。本研究有利于SS 动物模型的研究，并为抗SS 药物临床前药理学研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性BALB/c 小鼠，6～8周龄，体质量（18±2） g，购自昆明医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（滇）2019-0008，使用许可证号：SYXK（滇）K2015-0002。饲养于标准SPF环境，小鼠自由进食、饮水。实验开展前适应性饲养3 d。实验过程符合减少、替代和优化的3R原则。

1.1.2 主要试剂与仪器 氢溴酸东莨菪碱（爱必信上海生物科技有限公司，规格500 mg，批号：abs47000419）；固体氯化钠（天津市风船化学试剂科技有限公司，规格500 g，批号：210422）；氯化钠注射液（石家庄鹏海制药股份有限公司，规格250 ml，批号：2012062101）；SSA、SSB、ANA、BAFFR 和TNF-α ELISA 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司，规格：96T）；倒置显微镜（上海维翰光电科技有限公司，型号：50I）；多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司，型号：1510）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂的配制 称取氢溴酸东莨菪碱 0.100 8 g 于烧杯，加入100 ml 生理盐水玻棒搅拌溶解成1 mg/ml 的氢溴酸东莨菪碱溶液。置于4 ℃下保存待用。称取固体氯化钠1.401 3 g于烧杯，加入500 ml生理盐水玻璃棒搅拌溶解，配制成2.8 mg/ml的高渗盐水。置于4 ℃保存待用。

1.2.2 小鼠SS模型建立 SPF级BALB/c小鼠随机分为3组：正常组、氢溴酸东莨菪碱组和高渗盐水组（n=10）。小鼠适应性喂养3 d 后，除正常组外，氢溴酸东莨菪碱组小鼠经皮下注射氢溴酸东莨菪碱溶液，0.2 mg/次/20 g 体重（qid）。高渗盐水组小鼠经眼内缓滴氯化钠溶液，100 µl/（眼·次）（qid）。连续造模10 d。具体造模方案见表1。

表1 小鼠模型复制方案（n=10）Tab.1 Replicative regimen of mice models （n=10）

1.2.3 体质量变化检测 用小鼠秤测量每组小鼠体质量，1次/2 d。计算每组体质量变化百分比（%）。

1.2.4 饮水消耗量检测 在d1 时，以加满水的鼠水瓶重量作为起始重量M1（g），随后每2 d 称量鼠水瓶重量，再次记录作为Mn（g）。利用作差法ΔM饮水量=M1-Mn计算每组小鼠饮水消耗量（1 g≈1 ml）。结果保留1位小数。

1.2.5 泪液结晶形态检测 实验期间，采集泪液（1 次/5 d）。采用毛细玻璃管在小鼠眼内呲处收集泪液后转至载玻片，待其干后，置于倒置显微镜×200视野下观察泪液结晶形态。随机拍5～8 个视野，每个视野拍3～5张。

1.2.6 脾脏系数检测 实验结束后，剖取小鼠脾脏，去除其周围结缔组织，生理盐水清洗后滤纸吸干表面水分，称量其湿重。按公式：脾脏系数（mg/g）=脾脏重量（mg）/小鼠体质量（g），计算脾脏系数。

1.2.7 脾脏HE 染色 脾脏置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋，经切片、贴片、脱蜡和苏木素-伊红染色，乙醇脱水，中性树脂进行封片。将其置于倒置显微镜×100、×200 视野下观察，每片随机拍摄5～8 个视野。依据脾脏形态进行评价：0 级，脾脏结构完整，白髓、红髓结构清晰，脾小体结构完整、清晰、排列整齐；1 级，脾脏病理改变程度较小，脾小体结构较为整齐，体积较小，淋巴细胞较少，白髓增生程度有所缓解；2 级，脾脏红髓、白髓分布不规则，排列不均匀，白髓区域淋巴细胞轻度增生，白髓区轻度增宽；3 级，病理改变程度较大，脾脏白髓呈重度增生，生发中心突出，淋巴细胞减少，脾小体萎缩，数量减少，红髓髓索压迫变窄，脾小梁密集。

1.2.8 腺体组织淋巴细胞浸润评分 剖取颌下腺、腮腺于4%中性甲醛溶液固定48 h。经切片、贴片、脱蜡和苏木素-伊红染色，乙醇脱水，中性树脂进行封片。将其置于倒置显微镜×200 视野下观察，每片随机拍摄5～8 个视野。采用Chisholm-Mason 组织学评分标准评价腺体组织中淋巴细胞浸润程度。评分标准为：0 分，偶见淋巴细胞浸润；1 分，少量散在淋巴细胞浸润；2 分，淋巴细胞中度浸润（未成灶），伴有轻度实质损伤；3 分，偶见0～1 个淋巴细胞浸润灶，5 个低倍视野，伴有中度实质损伤；4 分，易见2～3 个淋巴细胞浸润灶，5 个低倍视野，伴有重度实质损伤。＞2分为发病。

1.2.9 血清中抗体和炎症因子表达量检测 参照ELISA 试剂盒说明书检测血清中自身抗体SSA 和SSB、抗核抗体ANA、炎症因子BAFFR 和TNF-α 表达量。利用多功能酶标在450 nm 波长下依序测定吸光值。依据标准品曲线方程计算血清中抗体和炎症因子的表达量。

1.3 统计学处理 利用 SPSS26.0 软件进行数据处理；计量资料以±s表示，进行独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。利用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果

2.1 小鼠体质量变化 实验期间正常组小鼠体质量呈增长趋势。与正常组相比，高渗盐水组与东莨菪碱组小鼠体质量变化百分比均下降（P＜0.05，P＜0.01）；与高渗盐水组相比，东莨菪碱组小鼠体质量变化百分比下降幅度有显著差异（P＜0.01）。见图1A。

2.2 小鼠饮水量消耗 实验期间正常组小鼠饮水量相对稳定。与正常组相比，东莨菪碱组与高渗组的饮水量显著增加（P＜0.05）；与高渗组相比，从d6开始，东莨菪碱组小鼠饮水量消耗显著增加（P＜0.05）。见图1B。

图1 各组小鼠体质量变化百分率和饮水量消耗变化（n=10）Fig.1 Percentage of weight changes and water consumption of mice in each group （n=10）

2.3 泪液结晶形态变化 图2显示，正常组小鼠泪液分泌量多，泪液结晶呈形态良好的蕨类物形状 （Ⅰ型）。高渗盐水组和东莨菪碱组小鼠泪液分泌均减少，其中东莨菪碱组最少。高渗组泪液结晶呈蕨类物形状，边界不清且形状不规则（Ⅲ型），东莨 菪碱组泪液结晶中蕨类物形状减少，分布散乱 （Ⅳ型）。

图2 小鼠泪液结晶形态变化（×200）Fig.2 Morphological changes of tear crystal form of mice （×200）

2.4 脾脏系数 图3A、3B 显示，与正常组相比，高渗盐水组脾脏湿重和脾脏系数差异无统计学意义，而东莨菪碱组脾脏湿重和脾脏系数显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与高渗盐水组相比，东莨菪碱组脾脏湿重显著增加，脾脏系数显著提高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 脾脏HE 染色 图4 显示，正常组脾脏结构完整，白髓、红髓结构清晰，脾小体结构完整、清晰、排列整齐（0 级），而东莨菪碱组小鼠脾脏白髓呈重度增生，生发中心突出，病理改变程度较大，淋巴细胞减少，脾小体萎缩，数量减少，红髓髓索压迫变窄，脾小梁密集（3 级）；高渗盐水组白髓增生程度有所缓解，脾脏病理改变程度较小，脾小体结构较为整齐，体积较小，淋巴细胞较少（1级）。

图4 各组脾脏HE染色（HE，n=10）Fig.4 HE staining of spleens in each group （HE， n=10）

2.6 颌下腺、腮腺HE 染色及其淋巴细胞浸润评分 图5 显示，正常组小鼠颌下腺分泌黏液和浆液性的腺泡结构完整，导管无阻塞、狭窄。与正常组（0 级）相比，东莨菪碱组小鼠颌下腺中腺泡结构破坏，导管阻塞、狭窄而导致颌下腺发生逆行性炎症的程度较高，有脓性分泌物自导管口溢出（3 级）；而高渗盐水组中分泌黏液和浆液性腺泡结构较为完整，少有导管阻塞、狭窄和脓性分泌物溢出（1级）。图5 显示，正常组小鼠腮腺浆液性腺泡明显可见，闰管长，在腺小叶内可见，无皮脂腺（0 级）。与正常组相比，东莨菪碱组腮腺浆液性腺泡较少，闰管不一，染色浅，在腺小叶内少见，可见皮脂腺和淋巴（3 级）；而高渗盐水组腮腺浆液性腺泡明显可见，闰管长，染色浅，在腺小叶内可见，无皮脂腺（1级）。图3C显示，与正常组相比，高渗组小鼠颌下腺、腮腺组织中淋巴细胞浸润程度差异均无统计学意义（P＞0.05），而东莨菪碱组中淋巴细胞浸润程度均显著升高（P＜0.01）。

图3 小鼠脾脏重量、脾脏系数和分泌腺组织淋巴细胞浸润评分（n=5）Fig.3 Weight and indexes of spleens and lymphocyte infiltration scores of endocrine glands of mice （n=5）

图5 各组颌下腺和腮腺HE染色（HE，n=10）Fig.5 HE staining of submandibular gland and parotid gland in each group （HE， n=10）

2.7 血清中自身抗体表达量 图6A、6B 显示，与正常组相比，东莨菪碱组血清中自身抗体SSA、SSB和抗核抗体ANA表达量均显著升高（P＜0.01），但高渗盐水组仅SSA 表达量显著升高（P＜0.05），而SSB、ANA 表达量差异无统计学意义。与高渗盐水组相比，东莨菪碱组表达量均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。表明东莨菪碱可显著促进小鼠体内自身抗体和抗核抗体表达。

2.8 血清中BAFFR 和TNF-α 表达量 图6C、6D 显示，与正常组相比，东莨菪碱组血清中BAFFR、TNF-α表达量均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；但高渗盐水组仅TNF-α 表达量升高（P＜0.05），BAFFR表达量变化差异无统计学意义。东莨菪碱组血清中BAFFR 表达量显著高于高渗盐水组，差异有统计学意义（P＜0.01）；但两组TNF-α 表达差异无统计学意义。表明东莨菪碱均能促进BAFFR蛋白和TNF-α 表达，但高渗盐水仅能促进TNF-α表达。

图6 各组小鼠外周血清中自身抗体和炎症因子表达（n=10）Fig.6 Expression levels of auto-antibodies and inflammatory factors in peripheral blood of mice in each group （n=10）

3 讨论

SS 发病机制复杂不清，现阶段仍缺乏一个能真实、客观、全面地模拟SS 临床发病机制和表现的动物模型。目前已有多种复制SS动物模型的方法，如自发动物模型、基因工程动物模型、实验诱导型模型等。其中，实验诱导模型方法因其周期短和经济便利性仍是药理学研究中体内筛选的重要方法之一。本研究通过实验诱导方法，表明氢溴酸东莨菪碱法比高渗盐水滴眼法在复制SS模型上更有优势。东莨菪碱是具有抗胆碱活性的生物碱，其通过阻断毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M受体）阻断泪腺胆碱能受体，并通过抑制中枢神经系统调控抑制腺体分泌，其抑制作用强于阿托品［10-12］。这种抑制作用在一定程度上模拟了临床SS 患者的发病症状，如口干、眼干、分泌腺体功能降低、腺体结构萎缩和免疫炎症等。研究发现，氢溴酸东莨菪碱引起的干眼以泪液分泌减少为主，伴有免疫性炎症和细胞凋亡等多因素共同参与［12-14］。与高渗盐水滴眼局部诱导干眼相比，东莨菪碱对分泌腺的抑制作用更强［13，15］。皮下注射途径操作简单，既能避免全身用药的毒副作用，又能克服眼表用药的局部限制，使诱导造模作用持久［16］。因此，本研究为选择合理、经济快捷的造模方法提供依据，有利于提高抗SS 药物筛选效率，也为探索新的更接近临床SS发病机制的动物建模方法提供参考。原发性和继发性的SS 患者早期症状不典型，大部分以口干、眼干为首发症状。眼干可导致眼痒、干涩、眼红、异物感等一系列不适症状，严重者可引起失明。早期口干的迹象包括龋齿数量增加、反复感染或口腔溃疡及严重的牙龈疾病［17］。我国以眼干、口干症状就诊的主诉者较少，故临床常常忽视SS 的首发症状。现临床确诊主要依靠临床症状、组织病理学检查及对自身抗体、相关炎症因子表达水平检测的综合判断。自身抗体SSA、SSB 对SS 的诊断敏感度较高，具有重要的诊断价值［17-18］。抗核抗体ANA 能识别各种细胞核组分，特征性地出现于许多自身免疫性疾病的活动性及预后指标。TNF-α 虽然不作为SS 的特异性指标， 但其是判断感染程度和免疫功能的重要炎症因子之一［19-20］。B 淋巴细胞活化在SS 病程中具有关键作用，BAFF 是维持B 细胞功能的重要细胞因子，BAFF/BAFFR 能够激活PI3K-Akt-mTOR 信号通路，调节B 淋巴细胞的增殖、存活和活化。近年也结合了抗着丝点抗体、抗-α 胞衬蛋白、抗线粒体抗体M2亚型（AMA-2）、抗毒蕈碱3 受体（M3R）抗体等指标［21］。随着SS发病机制的深入研究，新的特异性生物标志物将被发现并应用于SS治疗。