NRP1调控M2型巨噬细胞极化介导电离辐射肺纤维化的作用研究①

佘 炜 魏 江 董丹丹 赵 原 顾 露⑤

（四川医学科学院·四川省人民医院临床医学检验中心，成都 610072）

电离辐射肺纤维化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）是临床放射介入医学最常见的并发症［1］；例如胸部肿瘤放疗后往往伴随肺纤维化发生，造成患者预后较差，甚至是导致患者非原发性疾病死亡的原因［2］。肺纤维化作为一种进行性免疫相关疾病，其在早期可以逆转，中后期则难以逆转，其发病机制复杂，尚不完全明确。有研究表明巨噬细胞极化在肺纤维化发生过程中发挥重要调控作用，特别是M2 型巨噬细胞极化。研究指出辐射导致肺组织大量表达过氧化物（ROS），辐射中后期ROS 减少激活M2 型巨噬细胞，M2 型巨噬细胞通过分泌各种细胞因子激活肌成纤维细胞、促进上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）等，导致过多细胞外基质和胶原蛋白沉积，造成损伤部位过度修复，形成放射性肺纤维化［3-4］。

神经菌毛蛋白1（neurofibrin 1，NRP1）是最初在神经系统内被发现的一种多功能跨膜糖蛋白，已被证明在增强TGF-β1 信号传导和促进成纤维细胞发生EMT的过程中发挥重要作用［5-6］。但其与M2型巨噬细胞在RIPF中的作用如何尚未见报道，因此本研究拟通过体内实验探讨NRP1 与M2 型巨噬细胞在RIPF中作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 15 只10 周龄C57 雌性小鼠购自成都硕达实验动物有限公司。该品系的雌性小鼠已被证实对射线敏感程度高，8～10 周龄该品系雌性小鼠常用于经典放射性肺纤维化动物模型建立。饲养于四川省人民医院实验动物研究所，所有小 鼠均按照要求规范饲养和操作。小鼠随机分为对照组、RIPF组和EG00229组，每组5只。

1.1.2 主要试剂与仪器 3%戊巴比妥（30 mg/kg，上海新亚药业有限公司，国药准字H31020240）；苏木素（货 号：H9627）、0.7% 盐酸乙醇（货号：361526）、PBS（货号：11666789001）、伊红（货号：230251）、天青石蓝液（货号：1.09211）、天狼星红饱和苦味酸（货号：365548）购自Sigma；氨水（货号：3245324）、乙醇（货号：1244355）、二甲苯（货号：4533243）、中性甲醛液（货号：8765324）、甲醇（货号：129824）、丙酮（货号：2145676）、多聚甲醛（货号：5435676）购自四川协力化学试剂公司；Weigert染液（批号：ab245882）、马松液（批号：ab150669）、TNF-α 抗体（批号：ab181421）、IL-4 抗体（批号：ab178012）、TGF-β1抗体（批号：ab214031）购自Abcam；数字化医用X 射线摄影系统（AXIOM ARISTOS VX PLUS，西门子）；qRT-PCR 仪（型号：Veriti，Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 RIPF造模 3%戊巴比妥麻醉小鼠，RIPF组和EG00229 组小鼠放射科辐照总剂量6 Gy（该剂量可成功诱导小鼠肺纤维化且不会致死，本实验室研究过程均使用6 Gy 总剂量，模型具有稳定性和连续性），放射剂量2 Gy/min，EG00229 组放射前7 d 每天给药处理，浓度20 mg/kg［7］。辐射结束15 d 后处死小鼠，取肺组织，处死过程严格遵守小鼠无痛准则。

1.2.2 HE 染色 肺组织石蜡包埋，切片脱蜡，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化5 s；PBS 洗片后氨水处理再水洗，伊红染色5 min，水洗后乙醇、二甲苯处理，树脂封片。

1.2.3 马松染色 肺组织石蜡包埋脱蜡；Weigert染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s；洗片后用马松液染色5 min；最后经洗片、乙醇脱水后，二甲苯透明，树脂封片。

1.2.4 天狼星红染色 中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。加入天青石蓝液染10 min。蒸馏水洗3 次。天狼星红饱和苦味酸染30 min。无水乙醇分化和脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果胶原呈红色，胞核呈绿色，其他呈黄色。

1.2.5 免疫荧光染色 将肺组织用预冷的甲醇和丙酮混合液（1∶1）固定，于1%TritonX-100/PBS 中透化。洗片擦干后于4 ℃冰箱中与精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、抵抗素样分子α（resistin-like molecule alpha，FIZZ1）、几丁质酶3 样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，Ym1）、CD14（1∶1 000）抗体孵育过夜。次日以4%多聚甲醛固定4 h，与含15%蔗糖的PBS 共孵育4 h，去离子水清洗玻片，使用激光共聚焦扫描分析切片。

1.2.6 免疫组化 肺组织依次进行石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加入NRP1，Ⅰ型胶原（Collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）和α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA） 一抗，加入二抗，DAB 显色，复染细胞核，脱水封片及切片扫描仪扫描分析。

1.2.7 qRT-PCR TRIzol 和氯仿用于提取RNA，使用RNA 逆转录试剂盒将RNA 逆转录为性质稳定的cDNA。随后qRT-PCR 检测目的基因相对GAPDH的表达水平。反应条件设定如下：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。2-ΔΔCt法用于计算目的基因相对mRNA表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 ELISA 各组小鼠血清离心取上清和细胞上清液，根据ELISA 试剂盒操作步骤加入TNF-α、IL-4、TGF-β1 抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。

1.3 统计学分析 数据应用SPSS18.0 进行分析，计量资料均以±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIPF 小鼠肺组织中NRP1 表达升高促进电离辐射肺损伤 与对照组相比，RIPF 组小鼠肺组织中NRP1 表达显著升高，而EG00229 有效抑制NRP1 在肺组织中的表达（图1A、1B）。与对照组相比，RIPF组小鼠经X 射线辐射后肺组织损伤明显，小支气管黏膜部分损伤，伴有少量出血、渗出现象；肺泡间隔增宽，肺泡腔增大，部分肺泡断裂、融合，腔内有分泌物；EG00229显著改善X射线导致的肺组织损伤，EG00229给药组小鼠肺组织肺实质及间质有少量炎症细胞浸润，肺泡结构较完整，腔内分泌物减少，出血现象改善，炎症细胞浸润明显减轻，气管黏膜结构完整（图1C）。提示NRP1与电离辐射导致的肺组织损伤密切相关，且可能促进组织损伤。

图1 RIPF 小鼠肺组织中NRP1 表达增高促进电离辐射 肺损伤Fig.1 Increased expression of NRP1 in lung tissue of RIPF mice promotes ionization radiation lung injury

2.2 NRP1 促进RIPF 小鼠肺组织炎症因子表达 ELISA 检测三组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1 表达，结果表明：与对照组相比，RIPF 组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1 表达显著提高，而EG00229给药处理后可有效抑制RIPF小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1的表达。（图2）。

图2 三组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1表达Fig.2 Expressions of TNF-α， IL-4 and TGF-β1 in alveolar lavage fluid of mice in three groups

2.3 NRP1 促进RIPF 小鼠肺组织ECM 沉积 天狼星红和马松染色检测三组小鼠ECM 表达，结果表明：与对照组相比，RIPF 组小鼠肺组织中ECM 表达显著增多，而EG00229可有效抑制ECM 在肺组织中的表达（图3）。

图3 马松和天狼星红染色观察三组小鼠肺组织中ECM 沉积情况Fig.3 Masson and Sirius red staining to observe deposition of ECM in lung tissues of mice in three groups

免疫组化检测Col-Ⅰ和α-SMA表达，结果表明：与对照组相比，RIPF组小鼠肺组织中Col-Ⅰ和α-SMA表达显著增多，而EG00229 可有效抑制Col-Ⅰ和 α-SMA在肺组织中的表达（图4）。

图4 免疫组化观察三组小鼠肺组织中Col-Ⅰ和α-SMA表达Fig.4 IHC observation of expressions of Col-Ⅰ and α-SMA in lung tissues of mice in three groups

2.4 NRP1促进RIPF小鼠肺组织CD14表达 免疫荧光检测三组小鼠CD14 表达，结果表明：与对照组相比，RIPF 组小鼠肺组织中CD14 阳性细胞率显著提高，而EG00229 可有效抑制肺组织中细胞CD14阳性率（图5）。

图5 三组小鼠肺组织中CD14表达Fig.5 Expression of CD14 in lung tissues of mice in three groups

2.5 NRP1促进RIPF小鼠肺组织M2型巨噬细胞极化 免疫荧光检测三组小鼠M2 型巨噬细胞极化标志物Arg1、FIZZ1、Ym1 蛋白表达水平，结果表明：与对照组相比，RIPF 组小鼠肺组织中细胞Arg1、FIZZ1、Ym1 阳性率显著提高，而EG00229 可有效抑制肺组织中细胞Arg1、FIZZ1、Ym1阳性率（图6）。

图6 三组小鼠肺组织中Arg1、FIZZ1、Ym1表达Fig.6 Expressions of Arg1， FIZZ1 and Ym1 in lung tissues of mice in three groups

3 讨论

电离辐射是临床医学介入和放射科对胸部肿瘤患者进行的常规治疗方法，但其面临着胸部辐射导致的肺组织损伤纤维化并发症［8］。有研究证实，RIPF 是导致肿瘤患者预后不良的重要因素［9］，目前RIPF 的发生机制不完全明确，且尚无特异有效的治疗药物，因此RIPF 的发生机制、关键靶点和药物研发是放射医学的研究热点。

RIPF 作为一种免疫相关疾病，其发病机制复杂，目前尚不完全清楚［10］。有研究表明，免疫因素在RIPF发生过程中发挥十分重要的作用，如炎症因子TNF-α、IL-4、TGF-β1的释放持续性刺激肺受损部位，会导致受损部分炎症微环境形成，激活肺成纤维母细胞并大量分泌ECM［11］；巨噬细胞和中性粒细胞的异常激活，尤其是M2 型巨噬细胞激活，研究证明辐射中后期可激活M2 型巨噬细胞，M2 型巨噬细胞通过分泌各种细胞因子激活肌成纤维细胞，促进EMT 等，导致过多细胞外基质和胶原蛋白沉积，造成损伤部位过度修复，形成RIPF［12-14］。

NRP1 是最初在神经系统内发现的一种多功能的跨膜糖蛋白，已被证明与TGF-β1 信号传导通路和EMT 的激活密切相关，而TGF-β1 和EMT 是导致RIPF 的重要原因［6，15-17］，但有关NRP1 与M2 型巨噬细胞在RIPF中的作用关系研究尚未见报道，因此本研究通过RIPF 动物模型初步探讨NRP1 与M2 型巨噬细胞在RIPF中的作用。

本研究发现NRP1 在RIPF 小鼠肺组织中显著高表达，随后通过NRP1 特异性抑制剂EG00229 预先给药处理小鼠，结果发现随着NRP1 表达被抑制，RIPF 小鼠肺组织损伤明显缓解，提示NRP1 与RIPF的发生密切相关。观察抑制NRP1 表达对RIPF 发生过程中炎症因子TNF-α、IL-4、TGF-β1 表达的影响，结果表明抑制NRP1表达后，TNF-α、IL-4、TGF-β1表达显著降低，提示NRP1 可影响TNF-α、IL-4、 TGF-β1等炎症因子表达，对缓解肺组织损伤至关重要。Col-Ⅰ和α-SMA 是组织纤维化标志蛋白，是ECM 的重要组织成分，也是造成组织纤维化的关键蛋白［18-19］。本研究发现抑制NRP1 表达后Col-Ⅰ和 α-SMA 的表达被明显抑制，对缓解肺组织纤维化具有重要影响。

炎症因子的释放和ECM 的沉积往往提示巨噬细胞和中性粒细胞的激活［20］。CD14 是巨噬细胞和中性粒细胞激活的标志。巨噬细胞和中性粒细胞在电离辐射中被显著激活是电离辐射造成肺组织损伤纤维化的重要因素。因此本研究进一步检测了两种细胞CD14 阳性率，结果发现电离辐射导致细胞CD14 阳性率明显升高，而抑制NRP1 表达后细胞CD14 阳性率随之降低，提示NRP1 能够调控巨噬细胞和中性粒细胞的激活。研究已经证实M2 型巨噬细胞激活发挥促纤维化作用，本研究为检测NRP1 与M2 型巨噬细胞关系如何，抑制NRP1 后，检测了M2 型巨噬细胞激活标志蛋白Arg1、FIZZ1、Ym1 的表达水平，结果发现Arg1、FIZZ1、Ym1 表达随NRP1的抑制显著降低。说明NRP1对M2型巨噬细胞在RIPF中的激活具有正向调控作用，但其具体机制尚不明确，将是下一步研究的重点。

综上所述，本研究明确了NRP1 在RIPF 体内模型中表达显著上调，抑制其表达后RIPF免疫相关炎症因子、巨噬细胞和ECM 的激活被抑制，进一步发现NRP1 可能通过抑制免疫相关细胞M2 型巨噬细胞发挥促纤维化作用。以上结果初步表明了NRP1在RIPF的发生中发挥的作用，为下一步的研究奠定基础。