玄参提取物调控circ_0038467/miR-495 对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响①

余莉萍 余淑菁 李旭成 崔金涛 陆佳鑫 （武汉市中医医院急诊科，武汉 430000）

肺炎由细菌、真菌等微生物、免疫损伤等引起，肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的常见原因［1-2］。中草药具有抗炎、抗氧化等作用，并可用于肺炎治疗［3-4］。玄参属于玄参科玄参属植物，是我国传统中药，具有抗炎、抗菌等作用，研究表明玄参提取物可通过抑制氧化应激反应减轻肝脏损伤［5］。但玄参提取物与细菌性肺炎关系的研究较少。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由RNA 剪接产生的一种环状转录物序列，广泛存在于真核细胞的细胞质，并参与多种疾病发生发展过程。研究表明，脂多糖诱导的人支气管上皮样细胞中circ_0038467 表达上调，抑制其表达可通过充当miR-338-3p 海绵抑制炎症反应及细胞凋亡，减轻细胞损伤［6］。Circular RNA Interactome 预测显示，circ_0038467 与miR-495 存在结合位点，miR-495 可通过靶向ROCK1 抑制脂多糖诱导的人胚肺成纤维细胞凋亡和炎症反应［7］。因此，本研究探讨玄参提取物是否可通过调节circ_0038467/miR-495 表达影响肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 玄参提取物购自西安金绿生物工程技术有限公司；人肺泡上皮细胞A549与肺炎链球菌株购自美国ATCC；MTT 试剂购自上海碧云天生物；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD；IL-6、IL-10 检测试剂盒购自上海酶联生物；Trizol 试剂、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 购自美国Invitrogen；cDNA合成试剂与SYBR Green 试剂盒购自美国Thermo Fisher；si-NC、si-circ_0038467、miR-NC、miR-495 mimics、pcDNA-circ_0038467购自上海吉玛制药技术有限公司；circ_0038467 突变型与野生型荧光素酶载体购自吉玛基因；荧光素酶活性检测试剂购自美国Promega；兔抗人Cleaved-caspase3抗体与二抗购自北京中杉金桥生物。

1.2 方法

1.2.1 实验处理与分组 1×108CFU/ml 肺炎链球菌培养肺泡上皮细胞24 h，记为model组［8］。正常培养基培养的肺泡上皮细胞记为control 组。分别 加入含不同浓度（10、20、40 µg/ml）玄参提取物与 1×108CFU/ml 肺炎链球菌共同处理肺泡上皮细胞24 h，分别记为model+玄参提取物L 组、model+玄参提取物M 组、model+玄参提取物H 组［9］。参照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 转染试剂将 si-NC、si-circ_0038467分别转染至肺泡上皮细胞，转染成功后用1×108CFU/ml肺炎链球菌培养肺泡上皮细胞24 h，分别记为model+si-NC 组、model+si-circ_0038467 组。将pcDNA-circ_0038467 转染至肺泡上皮细胞，转染成功后用40 µg/ml 玄参提取物与 1×108CFU/ml 肺炎链球菌培养肺泡上皮细胞24 h，记为model+玄参提取物+pcDNA-circ_0038467组。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖 收集各组肺泡上皮细胞（2.5×104个/ml）接种于96 孔板（100 µl/孔），每孔加入MTT 溶液20 µl，培养4 h 后弃上清，每孔加入150 µl DMSO，避光振荡孵育5 min，酶标仪检测各孔光密度值（OD490）。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组肺泡上皮细胞0.25%胰蛋白酶消化，3 000 r/min 离心 6 min，弃上清，预冷PBS 洗涤，按照凋亡检测试剂盒说明检测细胞凋亡率。

1.2.4 ELISA 检测IL-6、IL-10 水平 收集各组肺泡上皮细胞培养上清，ELISA 检测IL-6、IL-10 水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 qRT-PCR 检测细胞circ_0038467、miR-495表达 Trizol 试剂提取各组肺泡上皮细胞RNA，反转录合成cDNA，PCR 扩增反应体系反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循环。2-ΔΔCt计算circ_0038467、miR-495相对表达。

1.2.6 双荧光素酶报告实验检测circ_0038467 与miR-495的调控靶向关系 采用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 转染试剂将Wt-circ_0038467、Mut-circ_0038467 分别与miR-NC 或miR-495 mimics共转染至肺泡上皮细胞，转染24 h 后收集细胞，检测细胞相对荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot 检 测Cleaved-caspase3 蛋 白 表达 收集各组肺泡上皮细胞加入适量RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜，封闭2 h，加入1∶1 000 稀释的Cleaved-caspase3 一抗与内参GAPDH 抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，37 ℃孵育二抗稀释液（1∶3 000） 1 h，Image J 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 玄参提取物对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响 与control 组比较，model 组细胞活力降低（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白水平升高（P＜0.05）；与model 组比较，model+玄参提取物L 组、model+玄参提取物M 组、model+玄参提取物H 组细胞活力升高（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白水平降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见图1。

图1 玄参提取物对细胞活性和凋亡的影响Fig.1 Effect of scrophulariaceae extract on cell viability and apoptosis

2.2 玄参提取物对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中炎症因子的影响 与control 组比较，model 组IL-6 水平升高（P＜0.05），IL-10 水平降低（P＜0.05）；与model 组比较，model+玄参提取物L 组、model+玄参提取物M 组、model+玄参提取物H 组IL-6 水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见图2。

图2 玄参提取物对炎症因子的影响Fig.2 Effect of scrophulariaceae extract on inflammatory factors

2.3 玄参提取物对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞circ_0038467、miR-495 表达的影响 与control 组比较，model 组circ_0038467 表达升高（P＜0.05），miR-495表达降低（P＜0.05）；与model组比较，model+玄参提取物L 组、model+玄参提取物M 组、model+ 玄参提取物H 组circ_0038467 表达降低（P＜0.05），miR-495 表达升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见 图3。

图3 玄参提取物对circ_0038467、miR-495表达的影响Fig.3 Effect of scrophulariaceae extract on expressions of circ_0038467 and miR-495

2.4 沉默circ_0038467 对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤炎症因子的影响 与model+si-NC 组比较，model+si-circ_0038467 组细胞活力升高（P＜0.05），细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白水平、IL-6水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.05），见 图4。

图4 沉默circ_0038467对细胞活性、凋亡炎症因子的影响Fig.4 Effect of silencing circ_0038467 on cell activity and apoptotic inflammatory factors

2.5 circ_0038467靶向调控miR-495表达 Circular RNA Interactome 预测显示，circ_0038467 与miR-495存在结合位点（图5A）。共转染野生型载体Wt-circ_0038467 的细胞实验中，miR-495 组细胞相对荧光素酶活性低于miR-NC组（P＜0.05，图5B）。

图5 circ_0038467靶向调控miR-495Fig.5 circ_0038467 targeting regulates miR-495

2.6 过表达circ_0038467 对玄参提取物处理的肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤炎症因子的影响 与model+玄参提取物组比较，model+玄参提取物+pcDNA-circ_0038467组细胞活力降低（P＜0.05），细胞凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白、IL-6 水平升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05，图6）。

图6 过表达circ_0038467可逆转玄参提取物对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞活性、凋亡及IL-6、IL-10 表达的影响Fig.6 Overexpression of circ_0038467 can reverse effect of scrophulariaceae extract on activity， apoptosis and expressions of IL-6 and IL-10 of alveolar epithelial cells induced by Streptococcus pneumoniae

3 讨论

circRNA 是编码序列的重要调控基因，在肺炎等多种疾病发生发展过程中发挥重要调控作用，其功能作用途径为充当miRNA 海绵调节靶基因表达，circRNA 在肺泡上皮细胞损伤中表达异常，并可能参与肺炎发生发展过程［10-11］。

本研究显示，玄参提取物可促进肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞增殖而抑制细胞凋亡。玄参提取物可减轻神经细胞损伤［12］；玄参提取物可通过抑制RAGE 和S100A8 表达减缓糖尿病肾病发展进程［13］。本研究显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中IL-6 水平升高，IL-10 水平降低，与相关报道结果相似［14］，进一步研究发现，玄参提取物可抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎症反应从而减轻细胞损伤。

circ_0038467 又称circ-UQCRC2，脂多糖诱导的人正常胚肺成纤维细胞中circ_0038467 表达上调［15］。本研究显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中circ_0038467 表达升高，而miR-495 表达降低。研究表明，miR-495在心肌缺血/再灌注损伤、内皮细胞炎症损伤中表达下调，上调其表达可抑制细胞凋亡减轻细胞损伤［16-17］。本研究进一步证实circ_0038467 可靶向结合miR-495，玄参提取物能够以浓度依赖方式降低circ_0038467 表达，而miR-495 表达升高，体外细胞实验证实，玄参提取物可能通过调节circ_0038467/miR-495 表达减缓细菌性肺炎发展进程。

综上，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中circ_0038467表达上调，而miR-495表达下调，circ_0038467与miR-495 存在靶向调控作用，玄参提取物可通过调节circ_003846/miR-495表达减轻细胞损伤。