响应面法优化球兰叶片总黄酮超声提取工艺

饶雪娥 朱宏阳 林贵灿 林伟铃

饶雪娥，朱宏阳，林贵灿，等.响应面法优化球兰叶片总黄酮超声提取工艺［J］.福建农业科技，2023，54（12）：35-40.

收稿日期：2023-10-10

作者簡介：饶雪娥，女，1986年生，实验师，主要从事天然药物开发利用。

基金项目：福建省中青年教师教育科研项目（JAT191292）；福建卫生职业技术学院院级科研项目（2019-01-06）。

摘  要：为了探究超声提取球兰叶片总黄酮的工艺条件，促进福建球兰的开发利用。以球兰叶片为主要原材料，通过超声辅助提取，设计单因素试验探究提取时间、料液比及提取温度对球兰叶片总黄酮提取率的影响，并在此基础上进行响应面优化试验。结果表明：球兰叶片总黄酮最佳提取工艺条件为提取时间40 min、料液比1∶35、提取温度40℃，此最佳提取工艺条件下球兰叶片总黄酮的提取率为125.28 mg·g-1，与模型方程理论预测值126.18 mg·g-1较接近。

关键词：球兰叶片；总黄酮；响应面法；超声提取

中图分类号：S 682.2     文献标志码：A     文章编号：0253-2301（2023）12-0035-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.005

Optimization of the Ultrasonic Extraction Technology of Total Flavonoids fromHoya carnosa Leaves by Response Surface Methodology

RAO Xue-e， ZHU Hong-yang， LIN Gui-can， LIN Wei-ling

（Department of Pharmacy， Fujian Health College， Fuzhou， Fujian 350101， China）

Abstract： In order to explore the process conditions of ultrasonic extraction of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa， and promote the development and utilization of Hoya carnosa in Fujian， the leaves of Hoya carnosa were used as the main raw material. Then， the effects of extraction time， solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa were investigated by designing the single factor experiment through the ultrasonic-assisted extraction. On this basis， the response surface optimization experiment was carried out. The results showed that the optimum extraction conditions for total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa were as follows： the extraction time of 40 min， the solid-liquid ratio of 1∶35， the extraction temperature of 40℃. Under the optimum extraction conditions， the extraction rate of total flavonoids from the leaves of Hoya carnosa was 125.28 mg·g-1， which was close to the theoretical predicted value of 126.18 mg·g-1 predicted by the model equation.

Key words： Leaves of Hoya carnosa； Total flavonoids； Response surface method； Ultrasonic extraction

球兰Hoya carnosa（Linn.f.）R.Br.别名爬岩草、草鞋板、铁脚板、绣球花、肺炎草等，它是一种常见的多年常绿攀援灌木，常附生于树上或石上，茎节上生气根，民间用作治疗关节肿痛、眼目赤肿、肺炎和睾丸炎等［1］。近年来受新型冠状肺炎疫情影响，许多患者患上各种肺热型咳嗽症状，针对如急慢性支气管炎，上呼吸道感染咳吐黄痰等症状，漳州市中医院开发的以球兰为原料提取的院内制剂——球兰止咳糖浆，临床实践应用证明具有良好的治疗效果。现代医学检验证明球兰植物体中还含有多种化学成分，主要包含孕（甾）烷、孕（甾）烷糖苷脂类、固醇类（植物甾醇、α-谷甾醇）、黄酮类、倍半萜类等［2］。黄酮化合物具有抗氧化［3-4］、抗菌［5］、抗肿瘤［6-7］、抗炎［8-9］、骨保护作用［10］等多种功能，提示了球兰可能具有的多种活性作用及其广阔的开发应用前景。

目前，黄酮类化合物的提取方法包括溶剂萃取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、碱提法以及传统的浸取法等［11-12］。本研究以球兰叶片为原料，基于超声波辅助获得，在巨大的振动环境、加速度较高、空化效应显著、持续搅拌等一系列的作用之下，促使黄酮物质的溶出［13］，通过非热作用实现强化提取［14］，对于液体、固体系最直接的影响也是机械效应［15］，与高温提取相比，超声波可以在常温状态下加速提取，且对提取物影响小。通过对球兰叶片总黄酮提取率的各个影响因素进行考察研究，最终确定试验因素水平，再利用响应面法优化球兰叶片总黄酮提取工艺，最终得到最佳的工艺提取条件，为后期进行活性成分分析及今后球兰的开发利用提供一定的理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

试验材料为球兰叶片，采摘于福建闽侯一带，经過烘干，粉碎过筛即得。

1.2  仪器与试剂

芦丁标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠等都是分析纯。752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；ZY2002型电子天平（上海蒲春计量仪器有限公司）；KQ-400VSM型超声波清洗器（昆山超声波清洗机有限公司）；800A型多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）。

1.3  单因素试验

1.3.1  提取时间对球兰叶片总黄酮提取率的影响  保持提取温度、料液比分别为40℃和1∶35，考察不同提取时间，即10、20、30、40、50、60 min的提取情况。

1.3.2  温度条件对球兰叶片总黄酮提取率的影响  保持提取时间、料液比分别为40 min和1∶35，考察不同提取温度，即20、30、40、50、60℃的提取情况。

1.3.3  料液比对球兰叶片总黄酮提取率的影响  保持提取时间、温度分别为40 min和40℃，考察不同料液比，即1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45的提取情况。

1.4  响应面优化试验设计

按照单因素试验结果，通过statistica 10.0软件设计试验方法，初步建立三因素三水平组合试验，其因素水平组合见表1，以料液比、提取时间、提取温度为3个影响因素，以球兰叶片总黄酮提取率为响应值，考察球兰叶片总黄酮提取的工艺条件。

1.5  球兰叶片总黄酮提取

球兰叶片烘干粉碎过筛后，准确称取1.00 g干粉，按一定的料液比加入95%的乙醇溶液，室温下浸泡5 min后，于超声波清洗器中进行40℃、40 min提取后，趁热抽滤，除去滤渣，留取滤液作为样品溶液。

1.6  总黄酮含量的测定

1.6.1  标准曲线绘制  准确称取球兰叶片粉末0.0010 g，选择特定体积分数酒精试剂，定容到0.1 L，晃匀，由此获得0.1 mg·mL-1的芦丁标准试剂，精密量取0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL芦丁标准品溶液置于10 mL量筒中，先加入5%的亚硝酸钠试剂0.3 mL，晃匀放置6 min，之后加入10%的硝酸铝试剂0.3 mL，晃匀放置6 min，而后加入4%的氢氧化钠试剂4 mL，最后加入氢氧化钠试剂直到刻度线为止，定容，摇匀静置20 min，进行充分显色反应。以试剂做空白参比液。置于510 nm波长节点检测吸光度情况。横纵坐标分别选择芦丁标准品浓度、吸光度，得到相应的曲线，并最终求解获得相关函数曲线A=10.159C+0.0043，R2=0.9997，显示有良好的线性关系［16］。

1.6.2  球兰叶片总黄酮提取率计算

R=A1×C×N×V12×A

公式中A1为样品溶液的吸光度；C为标准品的浓度；N为溶液的稀释倍数；V1为样品的体积；A为标准品的吸光度；R为总黄酮的提取率。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果分析

2.1.1  提取时间对球兰叶片总黄酮提取率的影响  由图1可知，超声提取时间10～60 min球兰叶片总黄酮的提取率总体呈上升趋势，在40 min时有个峰值，提取率达到最大。所以，选取40 min为最优的提取时间。

2.1.2  提取温度对球兰叶片总黄酮提取率的影响  由图2可知，当温度到达40℃时，球兰叶片总黄酮的提取率达到峰值，之后继续升高温度后发现提取率反而下降。因此，选取40℃为最优提取温度。

2.1.3  料液比对球兰叶片总黄酮提取率的影响  由图3可知，料液比在1∶20～1∶45范围内，随着料液比的升高，球兰叶片总黄酮提取率明显升高，在到达1∶35时呈最高峰状态，继续增加料液比，提取率反而变小。因此，确定料液比为1∶35。

2.2  球兰叶片总黄酮响应面法试验结果

2.2.1  响应面法优化试验结果  在单因素试验结果的基础上，以球兰叶片总黄酮提取率为响应值，

根据statistica 10.0试验设计原理，对料液比（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）3个主要影响因素进行三因素三水平的响应面试验设计，结果见表2。

2.2.2  回归方程的建立及模型分析  采用statistica 10.0软件对表1数据进行回归分析，得到响应值球兰叶片总黄酮提取率（Y）与料液比（X1）、 提取时间（X2）、 提取温度（X3）三因素的二次多元回归方程：Y=-10.520X1-17.410X12+8.891X2-20.150X22-1.485X3-19.719X33-7.980X1X2-4.635X1X3-11.375X2X3+124.491。再通过此软件对试验结果进行方差分析后得到的结果见表3。

由表3可知，该模型的显著性较高，相关系数R2=0.9275，说明该模型的拟合程度较好，由F值不难得到多个要素和提取结果的关联权重占比，即料液比最大，温度最低，中间为提取的时间，各因素对总黄酮提取率的互相影响比较不显著。

2.2.3  提取总黄酮工艺条件的响应曲面分析  应用statistica10.0软件，将各因素两两交互作用对球兰叶片总黄酮提取率的影响进行曲面分析，做出相应的3D响应面分析图及等高线图，结果见图4。

2.3  最佳条件试验验结果验证

通过statistica10.0软件得到球兰叶片总黄酮最佳提取要素，即料液比、提取时间、提取温度依次保持1∶33.19、36.83 min、39.14℃。为了试验操作的方便性，选取料液比为1

∶35（g·mL-1）、提取时间为40 min、提取温度为40℃，在此最佳条件基础上进行3次平行试验进行验证，得到的平均总黄酮提取率为125.28 g·mL-1，与模型预测值126.18 g·mL-1较接近。说明所建立的预测模型比较可靠，响应面法可以适用于优化球兰叶片总黄酮的提取工艺。

3  讨论与结论

关于中草药活性成分的提取研究，尤其是黄酮类化合物提取分离研究历史悠久，近年来随着科研设备仪器的日益更新换代，以及新的提取技术出现，越来越多植物内含的有效成分总黄酮被人们提取出来，大大提高植物的开发利用价值。本研究在单因素试验的基础上，采取响应面法对球兰叶片总黄酮提取工艺进行进一步优化。结果表明其预测模型具有相对可靠性和稳定性，三因素对球兰叶片总黄酮提取率关联权重占比关系中，料液比所占影响因素最大，提取时间次之，提取温度影响因素最低。本研究结果表明影响总黄酮提取率的三因素最佳配比为料液比、提取时间、提取温度分别为1∶35、40 min、40℃，此最佳提取工艺条件下得到的总黄酮提取率为125.28 mg·g-1。

球兰茎叶水提物的活性成分在体外抑菌性已得到试验验证。然而球兰提取物中许多其他已知和未知的活性成分功能尚待进一步研究验证，比如黄酮类化合物和皂苷类化合物是否具有降血糖和血脂效果，目前研究甚少。对于进一步利用其化学成分开发天然药物新药具有重要意义。球兰广泛分布于福建沿海区域加之民间药用疗效确切，通过现代技术手段提取分离其有效化学成分，可以使球兰药用价值进一步被挖掘利用，从而开辟新的药物来源，能更好地为人类健康事业注入新鲜血液。

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（责任编辑：林玲娜）