澳洲坚果生理落果期果柄离区形态学结构及细胞壁相关酶活性分析

李穆 李菊馨 曾黎明 黄锦媛 唐圣理 赵渊

摘  要：对比分析澳洲坚果早期生理落果期间正常果与脱落果果柄离区的形态学结构和细胞壁相关酶活性，为落果生理基础研究及生产上制定保果调控措施提供理论依据。通过制作石蜡切片观察果柄离区的形态学结构，采用生化微量法分别测定盛花后30 d、40 d、50 d果柄离区中纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性并分析其差异性。结果表明，正常果果柄表皮细胞排列紧密，无离层区域，而脱落果果柄具有明显的离层区域，离层由2～3层大体积、椭圆形的细胞松散排列组成，细胞间隙较大，木质化程度高于周围组织细胞；在澳洲坚果早期生理落果期间，脱落果果柄离区中纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性均显著高于正常果果柄。研究结果表明，果柄离层木质化程度、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶等细胞壁相关酶活性变化是造成澳洲坚果早期生理落果的重要因素。

关键词：澳洲坚果;离区;果柄；纤维素酶;多聚半乳糖醛酸酶

中图分类号：S664.9 文献标志码：A

Analysis of Morphological Structure and Cell Wall-Related Enzyme Activity in Carpopodium Abscission Zone of Macadamia during the Physiological Nut-Drop Period

LI Mu， LI Juxin， ZENG Liming， HUANG Jinyuan， TANG Shengli， ZHAO Yuan*

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： The morphological structure and cell wall-related enzyme activity in carpopodium abscission zone of normal and dropped macadamia nuts in the early physiological nut-drop period were compared for theoretical basis on physiological research of nut and the formulation of nut preservation control measures in production. Paraffin section was used to observe the morphological structure of carpopodium abscission zone of macadamia. The activity of cellulase and polygalacturonase enzymes in carpopodium abscission zone of macadamia on 30 d， 40 d and 50 d after flowering were tested by biochemical micromethod and their differences were analyzed. The results showed that the epidermal cells of the normal carpopodium were tightly arranged without the abscission zone， while the carpopodium of dropped nuts had obvious abscission zone. The abscission zone was composed of 2-3 large and elliptical cells that were loosely arranged， with larger cell gap and higher lignification degree than the surrounding tissue cells. During the early physiological nut-drop period， the activity of cellulase and polygalacturonase in carpopodium of dropped nuts were significantly higher than those in normal macadamia nuts. The results shows that the lignification degree of carpopodium abscission zone and the activity change of cell wall-related enzyme such as cellulase and polygalacturonase are the important factors causing the early physiological nut drop of macadamia.

Keywords： Macadamia; abscission zone; carpopodium; cellulase; polygalacturonase

果樹落花落果是一种较为普遍的现象，严重的落花落果会导致果树产量下降[1]。造成果树落花落果的直接原因是细胞壁降解松弛后致使离区细胞分离，从而引起果实脱落[2]。许多研究表明，纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶是植物细胞壁的两种主要降解酶，参与植物离层细胞的降解过程，前者主要降解植物细胞壁中的纤维素成分，后者则主要降解细胞壁中的果胶成分[3-5]。在柑橘、龙眼等果树中的研究表明，幼果脱落时纤维素酶活性均与落果率呈显著的正相关[6-8]。在桃、梨、荔枝等果树中的研究表明，多聚半乳糖醛酸酶在器官脱落中起着重要的作用[4，9，10]。

澳洲坚果（Macadamia spp.）是一种原产于澳大利亚的高档坚果类果树，其果仁富含多种营养成分，味美可口，是世界上最佳的食用干果之一，素有“干果皇后”的美誉[11]。中国于1910年引种澳洲坚果，1979年开始进行商业种植，2021年种植面积达32.68万hm2，成为世界上发展最快、种植面积最大的国家[12，13]。随着种植面积不断扩大，澳洲坚果表现出大量落花落果的现象，特别是早期生理落果，大量未成熟果实通常于盛花后20～50 d脱落[14]，严重影响果实产量的增加。

目前，国内有报道认为果柄的能量代谢可能参与了澳洲坚果响应饥饿胁迫所引起的果实脱落诱导调控[15]，而有关澳洲坚果果柄离区显微结构、细胞壁相关酶与果实脱落关系的研究还未见报道。因此，本研究以澳洲坚果正常果和脱落果果柄离区为样品，进行形态学观察和细胞壁相关酶（纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶）活性差异分析，为澳洲坚果落果机理研究和生产上采取相应措施防止果实脱落提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地位于广西壮族自治区亚热带作物研究所广西澳洲坚果良种培育中心试验基地（N22°54'8''/E108°20'4''）。选择树龄8年、树势较一致、生长势良好、无病虫害的澳洲坚果树为试验材料，株行距5 m×6 m，树体通风透光、枝条分层合理，以常规管理方式进行田间管理。

1.2 试验设计

以3株澳洲坚果树为1个重复单元，每个处理3次重复，分别在盛花后30 d、40 d、50 d采集正常果和脱落果果柄部位，一部分用于果柄离区的形态学观察，一部分经液氮速冻后带回实验室存放于-80 ℃冰箱，用于细胞壁相关酶活性的测定。

1.3 试验方法

1.3.1 石蜡切片制作及显微结构观察

切取果柄离区上下0.5 cm范围的组织，用FAA（无水乙醇∶冰乙酸∶甲醛∶水= 50∶5∶40∶5，添加少量甘油）固定24 h以上，参照张俊超等[16]方法进行切片制作及番红—固绿染色，利用显微镜观察离区的细胞组织形态，并采集分析具有典型结构的图像。

1.3.2 细胞壁相关酶活性的测定

纤维素酶活性的测定：称取约0.1 g样品，加入1 mL提取液（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为4.8），用移液器将溶液转移至1.5 mL离心管，于4℃，12000 r·min-1离心10 min，取上清至冰上待测。试验对纤维素酶采用纤维素酶（CL）活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC2545，规格：100T/48S）进行反应并在酶标仪进行测定。

多聚半乳糖醛酸酶活性的测定：称取约0.1 g样品，加入1 mL提取液（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为6.0），用移液器将溶液转移至1.5 mL离心管，于4℃ 12000r·min-1离心10 min，取上清至冰上待测。试验对多聚半乳糖醛酸酶采用多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC2660，规格：50T/24S）进行反应并用酶标仪进行测定。

1.4 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 19.0对测定数据进行统计及差异性分析。

2 结果与分析

2.1 果柄离区的形态学观察

通过显微观察发现，正常果和脱落果果柄存在明显差异：正常果果柄无离层区域（图1，a），表皮细胞排列紧密（图1，c）；而脱落果果柄具有明显的离层区域（图1，b），且离层由2～3层大体积、椭圆形的细胞松散排列组成，细胞间隙较大（图1，d），说明了相邻细胞间粘附力降低。从染色结果可见，离层细胞被番红染为深红色，而周围组织细胞被染为浅红色或未被染色，说明了离层细胞的木质化程度高于周围组织细胞。

2.2 果柄离区中纤维素酶活性的差异

纤维素酶是分解细胞壁纤维素基质多糖的关键酶。由图2可知，在澳洲坚果早期生理落果期间，正常果果柄离区中纤维素酶活性呈“先升后降”的变化趋势，脱落果前期趋势相近，但在盛花40 d后虽稍有下降但依然保持较高水平，且显著高于周期正常果；从整体上看，正常果果柄离区中纤维素酶活性极显著低于脱落果，说明澳洲坚果落果与纤维素酶的高活性相关，澳洲堅果果实脱落过程中纤维素 酶在果柄离区可能参与了细胞壁的降解。

2.3 果柄离区中多聚半乳糖醛酸酶活性的差异

多聚半乳糖醛酸酶是植物器官脱落过程中的主要代谢酶类之一。由图3可知，在澳洲坚果早期生理落果期间，正常果离区多聚半乳糖醛酸酶活性呈“升高”趋势，脱落果果柄离区多聚半乳糖醛酸酶活性呈“先升后降”的变化趋势；正常果和脱落果果柄离区在多聚半乳糖醛酸酶活力值存在极显著差异，说明了细胞壁可能被多聚半乳糖醛酸酶所降解。

3 讨论

离区是植物器官脱落发生的特定部位，一般由5～50层体积小且排列紧密的细胞构成，其中1～2层细胞分化为离层从而触发脱落[17]。前人研究发现，不同物种或不同器官的离层存在差异[18]，离区细胞与相邻细胞在形态学有明显的区别[19]。本研究对澳洲坚果果柄进行了细胞学观察发现，果柄离层细胞有2～3层，其木质化程度远远高于周围组织细胞，推测离层木质化程度是造成澳洲坚果早期落果的重要因素之一。

果实脱落过程中仅有离区的形成不一定会使果实脱落，果实脱落启动需要感受到特定的脱落信号[20]，而离区细胞感受脱落信号导致果实脱落的过程主要是一些细胞壁水解酶在起作用，其中多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶等是果实脱落的主要功能酶类[21]。有研究指出，在植物器官脱落中，纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶在离区中的活性呈现高表达的水平[22]。本研究中，在澳洲坚果早期生理落果期间，脱落果果柄中纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性均显著高于正常果，脱落果果柄离层细胞间隙变大，表明了在澳洲坚果果实脱落中，细胞壁可能被纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶所降解，使得细胞与细胞之间粘附力下降，从而发生分离，进而促进果实的脱落，这与龙眼[23]、葡萄[24]研究的结果一致。

然而，果实脱落是一个多方面调控的复杂生理过程，如高ABA/IAA比值能够增强离层细胞壁分解酶活性，促进离层的形成[25]；生长素和赤霉素均能抑制离区纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶活性的升高，以减少或阻止幼果脱落[26]；乙烯促进果实的脱落主要是活化了纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶两种酶的活性[27]；外源喷施乙烯诱导果实脱落的过程中，离区多聚半乳糖醛酸酶活性显著增加[4，21]。可见，脱落发生时细胞壁水解酶与内源激素协调调控器官脱落过程有关，而本研究仅仅关注细胞壁相关酶对澳洲坚果早期生理落果的响应，未开展其与内源激素等调节物质之间的相互作用机理分析。因此，关于澳洲坚果早期生理落果的调控机理和潜在分子机制有待进一步研究。

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责任编辑：谢红辉

基金项目：广西农业科学院基本科研业务费项目（桂农科2024YP131，2022YM11，2021YT155）；广西农业科学院科技先锋队“强农富民”“六个一”专项行动项目（桂农科盟202304-07）；广西科技基地和人才专项（桂科AD18281005）。

第一作者：李穆（1989—），女，硕士，助理研究员，研究方向为植物生理与分子生物學，E-mail：1009129466@qq.com。

*通信作者：赵渊（1992—），女，硕士，研究方向为植物病理学，E-mail：260650584@qq.com。

收稿日期：2023-08-11