四川省中江县丹参叶斑病病原鉴定与抑菌药剂筛选

2023-03-13范中菡陈庆华胡容平李洪浩

西南农业学报 2023年12期

邹欢,韩帅,范中菡,陈庆华,胡容平,李洪浩

(1.四川省农业科学院植物保护研究所,成都 610066;2.四川省农业科学院农业资源与环境研究所,成都 610066;3.四川省农业科学院,成都 610066)

【研究意义】丹参(SalviamiltiorrhizaBge)为双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生草本植物,别名赤身、紫丹参、红根等,其药用成分为丹参酮、隐丹参酮、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸等活性物质[1]。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦的功效[2]。四川省中江县是中国丹参主产区之一,中江丹参历史悠久、品质优,被列为川产道地药材,在四川道地药材中有着较高地位,也是中国中药丹参出口的主要品种之一[3]。由于丹参的需求量日益增多,野生资源不断减少,目前丹参多以人工栽培为主。随着种植面积逐年扩大,丹参的病虫害日益增多。叶斑病是为害丹参的主要病害之一,其症状为初期叶片出现不规则病斑,之后病斑变为深褐色,最后病叶干枯、脱落,整株枯死,严重影响丹参产量。【前人研究进展】叶斑病主要危害植物的叶片,发生程度与病原菌种类、环境条件和寄主抗病性相关。目前,对丹参叶斑病病原菌的研究较少。部分学者认为是由AlternariazinniaePape[4]或CercosporasalvicolaTharp[5]侵染导致。Garibaldi等[6]在总苞鼠尾草(S.involucrata)叶斑病病部组织中分离到大量病原菌,通过形态特征观察、ITS测序分析和致病性试验,该病原菌被鉴定为链格孢菌(A.alternata)。2016年叶斑病在台湾省花莲县丹参种植区普遍发生,Lu等[7]根据分生孢子梗和分生孢子形态特征将其鉴定为多主棒孢霉(Corynesporacassiicola),并通过ITS测序进一步验证形态鉴定。【本研究切入点】目前,国内外对引起鼠尾草属植物叶斑病的病原菌报道较少,主要为多主棒孢霉和链格孢菌,但由果生炭疽菌(C.fructicola)侵染丹参引起叶斑病的研究未见报道。【拟解决的关键问题】以中江丹参叶斑病病叶为材料进行病原菌的分离鉴定,结合致病性测定、形态特征观察和分子生物学明确丹参叶斑病病原菌种类,并针对性筛选有效药剂,以期为该病害的科学防控和促进中江丹参产业的可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病样丹参叶斑病病叶于2021年8月采自四川省德阳市中江县辑庆镇永远村,装于塑料自封袋中,带回实验室进行分离鉴定。

1.1.2 生化试剂 Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、10×Loading Buffer、引物ITS1/ITS4等均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 供试药剂 5种市面上常用的杀菌剂被用于室内药剂筛选,分别是80%代森锰锌可湿性粉剂(利民化学有限责任公司生产)、80%乙蒜素乳油(南阳新卧龙生物化工有限公司生产)、250 g/L嘧菌酯悬浮剂(英国先正达有限公司生产)、50%醚菌酯水分散粒剂(巴斯夫欧洲公司生产)、500 g/L氟啶胺悬浮剂(日本石原产业株式会社生产)。

1.2 试验方法

1.2.1 丹参叶斑病病原菌的分离与纯化采用组织分离法进行病原菌分离。将具有典型症状的病叶用无菌水清洗干净并拭去表面水分,取病健交界处0.5 cm×0.5 cm大小的病组织置于75%酒精中消毒2次,经无菌水漂洗3次后,用已灭菌滤纸拭去表面水分后转至PDA培养基平板中央,并将平板置于25 ℃黑暗条件下恒温培养,待菌丝生长、产生分生孢子后,通过单孢分离获得叶斑病病原菌的单孢纯化菌株。

1.2.2 丹参叶斑病病原菌的致病性测定选择健康无病斑丹参叶片洗净,75%酒精消毒后用无菌水冲洗,再用已灭菌滤纸拭干表面水分。病原菌在PDA培养基上培养5～7 d后,取菌落边缘直径5 mm菌饼作为接种体。刺伤接种:使用已灭菌接种针轻轻刺伤丹参叶片背面并做好标记,将菌饼接种于伤口处;不刺伤接种:直接将菌饼接种于丹参叶片背面,以接种无菌PDA作为对照。每片叶接种1个菌饼,每个处理重复接种3片叶,接种后将叶片置于25 ℃、12 h光周期条件下保湿培养,每日定时观察并记录叶片发病情况。丹参叶片发病后,从病斑处再次进行病原菌分离培养,并与原接种体进行比较。

1.2.3 丹参叶斑病病原菌的形态观察供试菌株在PDA培养基上培养7 d后,观察菌落形态并挑取适量菌丝于载玻片上,在显微镜下观察菌丝、分生孢子、子囊及子囊孢子形态。参考Yang等[8]的方法,观察孢子附着胞的产生情况。

1.2.4 丹参叶斑病病原菌的分子生物学鉴定刮取已在PDA培养基上生长7 d的病原菌菌丝,使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌丝DNA。利用真菌rDNA-ITS序列通用引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R和GDF/GDR[9]对病原菌相应的rDNA-ITS、ACT和GDPH基因分别进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系为:10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,Tag Plus DNA Polymerase(5 U/μL)1 μL,MgSO4(50 mmol/L)1 μL,上下游引物(10 μmol/L)和DNA模板各1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,进行30个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对,下载同源性较高的同属分离物序列(表1),利用MEGA软件,使用邻接法(Neighbor joining)构建基于rDNA ITS、ACT和GDPH联合的系统进化树,进行亲缘关系分析,确定病原菌的分类地位。

1.2.5 丹参叶斑病的抑菌药剂筛选采用菌丝生长速率法测定杀菌剂的抑菌活性:根据预备试验确定代森锰锌[10]、乙蒜素[11]、嘧菌酯[12]、醚菌酯[13]和氟啶胺[14]的最高浓度分别为5000、1000、1250、1250和800 μg/mL,并采用二倍稀释法梯度稀释,再用移液器分别吸取1 mL不同浓度药液加入9 mL PDA培养基中混匀制成含药培养基,以1 mL无菌水替代药液作为对照。用直径5 mm打孔器在已培养7 d的菌落边缘打孔,并将菌饼置于培养基平板中央,每个处理重复4次。在25 ℃黑暗条件下培养10 d,采用十字交叉法测量菌落直径,计算病原菌菌丝生长的抑制率(I,%)以及毒力回归方程、EC50值、相关系数r。

式中,A0为对照组菌落直径,At为处理组菌落直径。

表1 同属分离物序列

2 结果与分析

2.1 丹参叶斑病的病害症状和病原菌分离

2021年8月在四川省中江县丹参种植区进行田间病害调查,发现丹参植株下部有大量叶片出现褐色病斑。病斑初为褐色小点,周围有黄色晕圈,随后病斑扩大至圆形或近圆形,有时受叶脉限制呈多角形或不规则形,病斑转为深褐色,病健交界处明显,之后相连成片,整片叶呈褐色干枯(图1-A)。通过组织分离法从病斑处分离获得3株真菌,选择1株生长速度快的菌株进行试验,编号为DS-3。

2.2 丹参叶斑病病原菌的致病性测定

刺伤丹参叶片接种菌株DS-3,接种部位72 h后出现褐色斑点,并伴有黄色晕圈,之后病斑不断扩大,6 d后病斑面积约占叶片的10%,呈深褐色(图1-B);未刺伤接种的叶片在6 d后也出现褐色病斑,但病斑较小(图1-C);未接种叶片无症状(图1-D)。对接种后发病组织进行病原菌分离,获得与DS-3菌落形态和微观特征一致的菌株。通过柯赫氏法则验证,该病原菌DS-3为引起丹参叶斑病的致病菌。

2.3 丹参叶斑病病原菌的形态学特征

供试菌株DS-3在PDA培养7 d后菌落呈灰绿色,边缘菌丝为白色(图2-A)。菌株培养18 d后产生黑色的子囊壳,子囊孢子以束状螺旋的方式环绕于子囊内(图2-B),子囊孢子呈弯月形(图2-C)。分生孢子无色,无隔或有隔,长椭圆形,孢子附着胞深灰色,近圆形或梨形(图2-D)。

2.4 丹参叶斑病病原菌的分子生物学鉴定

对病原菌DS-3的rDNA-ITS、ACT和GDPH基因进行PCR扩增,分别获得长度为534、262、259 bp的目的片段,上传至NCBI数据库并获得登录号,分别为OR538885、OR545810和OR545811。将ITS序列进行BLAST比对,发现DS-3与番木瓜炭疽病菌(C.chrysophilum)、果生炭疽菌(C.fructicola)和胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的相似度均为100%,不能区分。将DS-3的3个基因进行线性拼接,使用MEGA 7.0,以Alternariaalternata为外群,与17条同属分离物的相应序列构建系统发育树可知(图3),DS-3以100%的支持率与果生炭疽菌的分离物C-517、JZB330267和YJMB4.2聚为一支,与炭疽菌属的其它种亲缘关系相对较远。

A:丹参叶斑病田间症状;B:刺伤叶片后接种DS-3的发病症状;C:未刺伤叶片接种DS-3的发病症状;D:空白对照。A: Field symptoms of leaf spot disease on S.miltiorrhiza; B: Stab-inoculation symptoms of strain DS-3; C: Inoculation symptoms of strain DS-3; D: Blank control.

A:培养7 d后病原菌菌落形态;B:子囊;C:子囊孢子;D:分生孢子和孢子附着胞。A: Morphology of pathogen colony after 7 days of culture; B: Asci;C:Ascospores;D: Conidia and appressorium.

图3 基于rDNA-ITS、ACT和GDPH基因联合构建的丹参叶斑病菌与相关菌株的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of S.miltiorrhiza leaf spot pathogen and related strains based on the combination of rDNA-ITS, ACT and GDPH genes

2.5 5种供试药剂对丹参叶斑病菌的抑制作用

从表2可知,不同药剂对丹参叶斑病菌的抑制效果差异明显。80%乙蒜素乳油的EC50值最低,为19.18 μg/mL;其次为500 g/L氟啶胺悬浮剂与80%代森锰锌可湿性粉剂,EC50值分别为125.53和159.47 μg/mL,250 g/L嘧菌酯悬浮剂和50%醚菌酯水分散粒剂的抑菌效果相对较差,EC50值分别为171.71和217.65 μg/mL,说明供试菌株对乙蒜素较为敏感。

表2 5种药剂对菌株DS-3菌丝生长的抑制作用

3 讨论

本研究通过柯赫氏法则、形态学和分子生物学方法,明确引起中江丹参叶斑病的病原菌为果生炭疽菌。果生炭疽菌的寄主广泛,包括咖啡、苹果、沙梨、补血草、草莓、鳄梨、无花果、薯蓣、可可、辣椒、白黄麻、番荔枝、杧果、香樟等[15-16]。在草莓上引起炭疽病[17],发病初期在叶片和叶柄上可见病斑,后期可致草莓整株枯死。果生炭疽菌也是油茶炭疽病[18-21]的主要病原菌之一,在湖南、湖北、重庆和福建等地均有发生,引起油茶落叶、落果。赵飞飞等[22]从2种症状类型的梨病叶上分离到2株菌落形态有差异的果生炭疽菌,两者的子囊孢子均可形成2种类型的菌落,一种为正型(+)单孢系,菌丝密集、较白,子囊壳聚生,另一种为负型(-)单孢系,菌丝为灰色,子囊壳散生。本研究分离获得的菌株DS-3的菌落形态与后者相似,为负型(-)单孢系,其分生孢子为长椭圆形,子囊孢子为弯月形,与李河等[21]报道一致。

炭疽菌属真菌的分类主要依据分生孢子、附着胞的形态特征和菌落的培养性状等指标,但某些近缘种种间的培养性状和形态特征差异小,且某些种的形态特征不稳定,因此,仅依靠微观形态来区分炭疽菌属的近缘种较困难[9]。随着分子生物学的不断发展,基于ITS等序列的分子技术已广泛应用于炭疽菌属真菌的分类鉴定中,但ITS序列存在局限性,Wire等[23]对C.gloeosporioide复合群进行基于ITS的系统进化分析,发现有13个种不能被准确识别,表明ITS序列不能有效区分炭疽菌属的近缘种。本研究仅依靠ITS序列进行系统发育分析,不能区分香木瓜炭疽菌、果生炭疽菌和胶孢炭疽菌,加入ACT和GDPH基因进行联合建树可准确鉴定到种。

本研究中,5种常用杀菌剂对果生炭疽菌的菌丝生长均有不同程度抑制效果,其中,果生炭疽菌对乙蒜素和氟啶胺较敏感,以乙蒜素为甚。氟啶胺是唯一的线粒体氧化磷酸化解偶联剂,具有广谱杀菌活性,抗性风险较低。氟啶胺对炭疽菌属中的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides、果生炭疽菌(C.fructicola)、博宁炭疽菌(C.boninense)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)的菌丝生长具有明显的抑制作用,EC50值介于0.028～0.53 μg/mL[24],显著低于本研究的结果,这可能与针对的病原菌不同有关。乙蒜素是我国自主研发的一款植物仿生杀菌剂,其通过渗透溶解病原体的细胞膜,干扰蛋白质合成,进而抑制病原菌的生长,可防治多种病害[25-26]。中国农药信息网农药登记数据显示,乙蒜素已登记用于防治大豆紫斑病、油菜霜霉病、水稻烂秧病、甘薯黑斑病、苹果叶斑病、棉花枯萎病等多种病害。同时,乙蒜素在作物中消解速度较快,在土壤中半衰期短,属于易降解农药。为进一步提升丹参叶斑病综合防控水平,保障道地中药材丹参产量和品质,可推荐乙蒜素用于丹参叶斑病的防控。