不同种源黄果厚壳桂种子脂肪酸组成及叶片化学成分差异

刘 莉,覃静婷,刘世男,覃永华

(1.广西壮族自治区南宁树木园,南宁 530032;2.广西大学林学院/广西高校亚热带人工林培育与利用重点实验室,南宁 530004;3.广西壮族自治区林业勘测设计院,南宁 530011)

【研究意义】黄果厚壳桂(Cryptocaryaconcinna)是樟科(Lauraceae)厚壳桂属(Cryptocarya)常绿阔叶乔木,主要分布于我国广东、广西、江西、云南、香港和台湾等省(区)[1],其木材特性良好,可作家具和建筑材料[2]。已有研究表明,许多樟科树种的种子或叶片中均含有较高的脂肪酸。黄果厚壳桂天然更新能力强,轮伐周期短[3],在林木采伐过程中通常仅取其木材,剩余部位因得不到合理利用而被废弃,造成资源极大浪费。因此,探究黄果厚壳桂果实的油脂特性及叶片的挥发油含量和成分,对黄果厚壳桂的综合开发利用具有重要意义。【前人研究进展】近年来,有较多科研工作者对樟科不同树种的油脂组成及化学成分进行了初步研究。王静平等[4-5]研究表明,樟属(Cinnamomum)和木姜子属(Litsea)植物的种子中脂肪酸含量较高,油脂的主要成分为癸酸、月桂酸和豆蔻酸,而厚壳桂属和鳄梨属(Persea)种子中油脂的主要成分为棕榈酸、油酸和亚油酸。王金华等[6]、侯敏等[7]研究发现,米槁(C.migao)种子和茶果樟(C.chago)种子的油脂含量均在55.00%以上,并检测出月桂酸、癸酸和油酸等9种脂肪酸,且饱和脂肪酸含量高于不饱和脂肪酸。邱凤英[8]研究指出,从黄樟(C.parthenoxylon)叶片提取的精油中共检测出117种化学成分,其中桉叶油素具有杀菌防腐作用。胡文杰等[9]对脑樟(Camphortype)不同部位的研究结果表明,脑樟6个部位的精油成分中共鉴定出60种化学成分,其中含量较高的樟脑成分具有消炎、镇痛、抗菌和止咳等作用。Wang和Liu[10]研究发现,山苍子(Litseacubeba)不同部位精油的主要成分为柠檬醛、β-芹烯和β-萜品烯,其精油具有抑菌、抗炎、驱避害虫和抗氧化等功能。徐柳云[11]研究表明,从贫花厚壳桂(C.depauperata)枝叶的油脂中共检测出35种化学成分,其中含量最高的是具有杀虫抗菌作用的α-吡喃酮类化合物。黄伟[12]采用多种色谱分离方法,对黄果厚壳桂的次生代谢产物进行分离和鉴定,结果发现从黄果厚壳桂中可分离出44种化合物,且绝大多数化合物具有抗菌及抑制癌细胞扩散作用。Nurdin等[13]在黄果厚壳桂的树皮中发现一种新香豆素类化合物,岳贤[14]研究表明该种化合物具有独特的生物活性和良好的光学特征,可用于合成荧光探针。前人从黄果厚壳桂中分离鉴定了45种化合物,但受到多种因素的影响其成分及相对含量差异较明显[12-13]。【本研究切入点】当前,对樟科不同树种油脂特性和化学成分的研究已取得一定进展,但关于不同种源黄果厚壳桂种子挥发油的脂肪酸组成及叶片挥发油成分和含量的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以广西金秀、永福和上思等8个种源黄果厚壳桂的种子和叶片为试验材料,采用索氏抽提法提取挥发油,测定种子含油率,利用气相色谱仪(GC)分析种子挥发油的脂肪酸组成,利用气相色谱—质谱(GC-MS)联用仪测定叶片的挥发油化学成分,剖析黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分类型和含量,为黄果厚壳桂资源的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄果厚壳桂新鲜果实和叶片分别于2020年10月和2021年1月采自广西金秀(JX)、永福(YF)、龙胜(LS)、上思(SS1和SS2)、桂平(GP)、隆安(LA)和武鸣(WM)7个县(区),其分布见表1。

表1 8个种源黄果厚壳桂的分布情况

主要仪器设备:DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海冉绘实业有限公司)、JT-SXT-02型索氏脂肪测定仪(杭州聚同电子有限公司)、DE100型微型植物粉碎机(杭州研和实验仪器有限公司)、RE-52AA型旋转蒸发仪(南京大卫仪器设备有限公司)、Agilent 7890A型GC仪(美国安捷伦公司)、Agilent 6890N-5975B GC-MS联用仪(美国安捷伦公司)。主要试剂:石油醚(烟台市双双化工有限公司)、异辛烷、氢氧化钾和甲醇(南宁壹棵松生物科技有限公司)、无水硫酸钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 将采摘的黄果厚壳桂成熟果实和新鲜叶片带回实验室,种子去除果皮后装入干净铝盒,叶片装入干燥信封,置于60 ℃电热恒温鼓风干燥箱烘干,然后分别用高速粉碎机粉碎,再次将其烘干至恒重,用封口袋密封保存备用。

参考陈晓等[15]的方法以索氏提取法提取黄果厚壳桂种子和叶片的挥发油。向滤纸筒加入经预处理的黄果厚壳桂种子粉末2.00 g,加入石油醚至烧瓶容积的2/3,于水浴上加热回流提取,至抽提管内的溶剂用玻璃棒检查无油迹为止。取下接收瓶,利用旋转蒸发仪减压蒸馏回收石油醚。待油样冷却后称重,3次重复。黄果厚壳桂叶片挥发油按照上述方法提取和萃取,置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 脂肪酸组成及含量分析 采用GC法测定黄果厚壳桂种子挥发油的脂肪酸组成。脂肪甲酯化处理参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》,以Agilent 7890A型GC仪进行检测。通过对比脂肪酸甲酯标准品保留时间,采用面积归一化法确定脂肪酸中的各成分含量,计算各成分的相对含量。

1.2.3 叶片化学成分测定 采用GC-MS联用技术测定黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分,计算其含量。GC工作条件:采用DB-5MS型色谱柱(60.00 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氦气(99.999%),流速为1.5 mL/min,不分流,进样量1.0 μL,程序升温,从140 ℃开始,保持2 min后,以4 ℃/min的速度升温至200 ℃保持5 min,再以4 ℃/min的速度升至250 ℃并保持15 min,气化室温度220 ℃。MS工作条件:质谱仪在70 eV的EI模式下对50～800 m/z范围完成扫描,设离子源温度为230 ℃,四级杆温度为150 ℃,溶剂延迟时间为6 min。

采用NIST 08标准谱库进行检索匹配,查阅相关文献进行人工解谱,比对确定化合物成分,用面积归一化法确定各成分的相对含量。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理,以SPSS 22.0进行单因素方差分析,以Duncan’s新复极差法进行多重比较,同时对各指标进行Pearson相关性检验。

2 结果与分析

2.1 黄果厚壳桂种子含油率分析

从图1可看出,从SS1、SS2、GP、JX、YF、LS、LA和WM 8个种源黄果厚壳桂种子中均能提取挥发油,其含油率分别为2.50%、1.80%、2.20%、3.10%、4.67%、4.30%、2.30%和1.70%,排序为YF>LS>JX>SS1>LA>GP>SS2>WM。其中,YF种源种子的含油率显著高于其他7个种源种子(P<0.05,下同),约为其他种源种子的1.09～2.75倍,而WM种源种子的含油率最低,但与SS2种源种子差异不显著(P>0.05,下同)。说明不同地理种源黄果厚壳桂种子的含油率差异明显,以YF种源种子的含油率最高。

图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters on the bar represent significant difference(P<0.05).

2.2 黄果厚壳桂种子挥发油的脂肪酸组成及相对含量

由表2可知,8个种源黄果厚壳桂种子挥发油中均含有9种类型脂肪酸,分别为棕榈酸、硬脂酸、花生酸、棕榈烯酸、油酸、顺-11-二十碳烯酸、亚油酸、α-亚麻酸和11,14-二十碳烯酸,其中,棕榈酸、硬脂酸和花生酸为饱和脂肪酸,其余6种为不饱和脂肪酸;脂肪酸中以不饱和脂肪酸为主,其含量为76.45%～81.15%(平均为78.53%),含量最高的为SS2种源,最低的为YF种源;不饱和脂肪酸中的多不饱和脂肪酸含量平均为63.34%,以亚油酸的相对含量最高,在54.77%及以上(平均为59.79%)。说明黄果厚壳桂种子挥发油属于富含不饱和脂肪酸的植物油脂,可作为功能性油脂进行开发利用。

续表2 Continued table 2

黄果厚壳桂种子中棕榈酸的相对含量平均为18.42%,硬脂酸的相对含量平均为2.58%,而花生酸的相对含量平均为0.44%;8个黄果厚壳桂种源种子的棕榈酸相对含量间差异明显,其中,YF种源种子的棕榈酸相对含量为20.57%,显著高于其他种源,SS1和LA种源种子的棕榈酸相对含量均在19.60%及以上,处于较高水平,而SS2种源种子的棕榈酸相对含量为15.87%,处于最低水平;硬脂酸和花生酸的相对含量均较低,其中,JX种源种子的硬脂酸相对含量为3.32%,其余7个种源种子的硬脂酸相对含量均在2.72%及以下;WM种源种子的花生酸相对含量为0.52%,其余7个种源种子的花生酸相对含量均在0.47%及以下;种子中的饱和脂肪酸含量约为总油脂含量的21.00%,以棕榈酸为主,硬脂酸次之,花生酸最少。

综上所述,不同种源黄果厚壳桂种子挥发油的脂肪酸含量存在一定差异。其中,亚油酸的相对含量最高(平均为59.79%),其次为棕榈酸(平均为18.42%)和油酸(平均为14.31%),硬脂酸(平均为2.58%)和α-亚麻酸(平均为2.06%)的相对含量较低;碳链长度在C16～C20之间,说明黄果厚壳桂种子挥发油的脂肪酸组成高度集中,有利于种子挥发油的加工利用。

2.3 黄果厚壳桂叶片的化学成分分析

2.3.1 化学成分的种类及相对含量 从8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油中共检测出89种化学成分。表3结果显示,8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油中豆甾烷-3,5-二烯的相对含量(LA种源45.01%,SS1种源39.51%,GP种源32.61%)和16-三十一酮(JX种源30.91%)较高,其次依次为氧化石竹烯(YF种源23.98%)、γ-谷甾醇(SS2种源23.45%)、2-异己基-6-甲基庚烯(LS种源15.79%)、植物醇(JX种源15.10%)、(E)-9-硬脂酸甲酯(JX种源13.67%)和2,5-二甲基环己酮(LS种源11.46%)。

从SS1种源叶片挥发油中检测出化学成分17种,其相对含量占SS1种源叶片挥发油总含量的99.99%,主要化学成分为豆甾烷-3,5-二烯(39.51%)、2-异己基-6-甲基庚烯(12.23%)、氧化石竹烯(9.58%)、2,5-二甲基环己酮(9.51%)和6,10,14-三甲基-2-十五酮(6.75%);从SS2种源叶片挥发油中检测出化学成分36种,其相对含量占SS2种源叶片挥发油总含量的99.98%,以γ-谷甾醇(23.45%)、2-异己基-6-甲基庚烯(11.81%)、2,5-二甲基环己酮(10.7%)、豆甾烷-3,5-二烯(8.81%)和氧化石竹烯(7.82%)为主;从GP种源叶片挥发油中检测出化学成分26种,其相对含量占GP种源叶片挥发油总含量的99.99%,主要化学成分为豆甾烷-3,5-二烯(32.61%)、氧化石竹烯(13.80%)、2-异己基-6-甲基庚烯(10.99%)、2,5-二甲基环己酮(7.25%)和2,6,10-三甲基十五烷(6.80%);从JX种源叶片挥发油中检测出化学成分50种,其相对含量占JX种源叶片挥发油总含量的100.00%,主要化学成分是16-三十一酮(30.91%)、植物醇(15.10%)、(E)-9-硬脂酸甲酯(13.67%)、棕榈酸甲酯(8.18%)和2,4-二叔丁基苯酚(6.55%);从YF种源叶片挥发油中检测出化学成分41种,其相对含量占YF种源叶片挥发油总含量的100.00%,主要化学成分为氧化石竹烯(23.98%)、桉叶油醇(8.86%)、2,6,10-三甲基十五烷(8.61%)、2-异己基-6-甲基庚烯(7.75%)和植物醇(4.88%);从LS种源叶片挥发油中检测出化学成分41种,其相对含量占LS种源叶片挥发油总含量的99.99%,主要化学成分为氧化石竹烯(18.70%)、2-异己基-6-甲基庚烯(15.79%)、2,5-二甲基环己酮(11.46%)、2,6,10-三甲基十五烷(7.77%)和豆甾烷-3,5-二烯(5.96%);从LA种源叶片挥发油中检测出化学成分13种,其相对含量占LA种源叶片挥发油总含量的100.00%,主要化学成分为豆甾烷-3,5-二烯(45.01%)、2-异己基-6-甲基庚烯(11.91%)、2,5-二甲基环己酮(8.66%)、6,10,14-三甲基-2-十五酮(6.31%)和环氧异芳香烯(6.29%);从WM种源叶片挥发油中检测出化学成分39种,其相对含量占WM种源叶片挥发油总含量的98.98%,主要化学成分为氧化石竹烯(16.59%)、2-异己基-6-甲基庚烯(13.79%)、2,5-二甲基环己酮(9.32%)、2,6,10-三甲基-十五烷(6.82%)和植物醇(4.86%)。

对表3结果进行统计可知,8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油中均含有氧化石竹烯、2,6,10-三甲基十五烷、植物醇和2,4-二叔丁基苯酚;JX种源叶片挥发油中含有16-三十一酮、硬脂酸甲酯和3,5-二(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯丙酸甲酯等28种特有化学成分;YF种源叶片挥发油中含有7-乙酰-2-羟基-2-甲基-5-异丙基双环[4.3.0]壬烷、(E,E)-5,9,13-十五碳三烯-2-酮和β-生育酚3种特有化学成分;LS种源叶片挥发油中含有β-苯丙酚酮和(E)-4-苯基-3-丁烯-2-酮2种特有化学成分;WM种源叶片挥发油中含有Δ-蛇床烯、十四烷和木质素酸甲酯3种特有化学成分。

表3 8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分比较

续表3 Continued table 3

续表3 Continued table 3

2.3.2 不同类型挥发油的化学成分差异 从8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油中鉴定出的89种化学成分,可划分为8种类型,分别为醇类20种、酚类2种、醛类1种、酮类11种、烷烃类8种、烯烃类24种、酯类19种和其他类4种。从图2～3可看出,在SS1、SS2和LA种源中烯烃类的数量最多,其相对含量分别占相应种源的63.34%、33.93%和66.69%;在GP、YF和LS种源中以醇类的数量最多,但其相对含量(分别为63.00%、41.08%和46.76%)均明显低于烯烃类的相对含量;在WM种源中醇类和烯烃类的数量相近,但相对含量以烯烃类较高,达44.43%;在JX种源中酯类的数量和相对含量均最多或最高;同一成分在不同种源黄果厚壳桂叶片中的相对含量差异较明显,如氧化石竹烯的相对含量为2.39%～23.98%,不同种源间的相对含量相差10倍以上;豆甾烷-3,5-二烯的相对含量为2.69%～45.01%,而在JX和YF种源的叶片中未检测出豆甾烷-3,5-二烯。可见,不同种源黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分及其相对含量存在明显差异。

图2 8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分类型数量比较Fig.2 Comparison of the number of chemical component types of volatile oil in the leaves of 8 provenances of C. concinna

图3 8个源黄果厚壳桂叶片挥发油中不同类型化学成分的相对含量比较Fig.3 Comparison of the relative contents of different types of chemical components of volatile oil in the leaves of 8 provenances of C. concinna

3 讨 论

含油率是评价种子或果实性状的重要指标[16]。本研究中8个种源黄果厚壳桂种子的平均含油率在1.70%～4.67%,其中,YF种源种子的含油率最高,LS种源种子次之,但均低于前人所测定樟科富油能源植物种子的含油率[17],说明不同种源黄果厚壳桂种子间的含油率存在差异,原因应与种源地环境和植物本身存在遗传多样性有关;8个种源黄果厚壳桂种子的挥发油中共鉴定出9种类型脂肪酸,其成分主要为亚油酸(54.77%～63.00%)、棕榈酸(15.87%～19.87%)和油酸(10.10%～17.80%),与付靖媛[18]的研究结果相似;不饱和脂肪酸含量为76.45%～81.15%,且其中的亚油酸相对含量均在54.77%及以上。已有研究表明,亚油酸很容易被空气氧化,用作生物柴油存在稳定性隐患[19],但亚油酸是人体必需的脂肪酸,具有预防心血管疾病和炎症发生、改善动脉硬化、提高免疫力及防治糖尿病等作用[20-22]。因此,黄果厚壳桂种子挥发油具有较高的营养和保健价值,可作为功能性油脂开发利用。

受不同种源的影响,黄果厚壳桂叶片挥发油的化学成分复杂多样[23]。本研究中,8个种源黄果厚壳桂叶片的挥发油中均含有氧化石竹烯、2,6,10-三甲基十五烷、植物醇和2,4-二叔丁基苯酚,但含量不同,说明黄果厚壳桂种源间叶片化学成分的相对含量差异明显,原因除其地理位置和气候环境两个因素不同外,还可能与自身的遗传基因调控差异有关;SS1、GP和LA种源叶片挥发油中含量最高的化学成分均为豆甾烷-3,5-二烯,分别达39.31%、32.61%和45.01%。已有研究表明,豆甾烷-3,5-二烯属于植物甾醇,因具有一定的生理活性而常被作为皮肤营养剂添加到化妆品中[24];植物醇具有抗炎和抗氧化活性,对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有抗菌活性,可调节肝脏中糖和脂肪的分化和代谢作用[25]。因此,黄果厚壳桂叶片挥发油也具有较高的营养和保健价值。本研究还发现,YF、LS和WM种源黄果厚壳桂叶片挥发油中相对含量最高的化学成分均为氧化石竹烯,分别为23.98%、18.70%和16.59%,其中,氧化石竹烯具有抑制蛋白表达、局部麻醉和抗炎功效[8,26];SS2种源叶片挥发油中相对含量最高的化学成分为γ-谷甾醇(23.45%),具有降胆固醇、止咳、祛痰及抑制肿瘤和修复组织等作用,表现出一定的药理特性[27];JX种源叶片挥发油中相对含量最高的化学成分是16-三十一酮(30.91%),但目前对16-三十一酮功效的研究鲜见报道,有待后期深入探究;8个种源黄果厚壳桂叶片挥发油中均含有特有化学成分,但含量相对较低,且多数为结构复杂、未确定的成分,后期应从分子角度分析其遗传多样性,以阐明黄果厚壳桂地理变异的分布规律。

本研究利用石油醚索氏提取法提取黄果厚壳桂种子和叶片的挥发油,操作简单、成本低、周期短,样本用量少,但能充分提取其中的脂肪酸和挥发性成分,与杨海涛和刘军海[28]的研究结果一致,可加大产业化发展规模,探寻黄果厚壳桂的可持续利用途径。

4 结 论

在8个种源黄果厚壳桂种子中,YF种源种子的挥发油提取率最高;8个种源黄果厚壳桂种子挥发油的不饱和脂肪酸含量均高于饱和脂肪酸含量;不同种源黄果厚壳桂叶片的挥发油中均含有多种共有化学成分和特有成分,但含量存在差异。因此,在香料工业、日用化工、制药工业和保健品开发方面可根据不同的油脂特性和化学成分含量选择合适的黄果厚壳桂种源。