长垣市副猪嗜血杆菌病分离鉴定、血清分型与耐药性检测

严洪涛

（长垣市农业农村局，河南 长垣 453400）

副猪嗜血杆菌（Hps）是引起猪格拉瑟氏病的重要病原。Hps作为猪上呼吸道的早期常见定殖菌，也是影响猪群健康的条件致病菌。在猪免疫力下降、免疫抑制或者外界应激作用下，通常引起病猪全身感染和多发性浆膜炎、肺炎、脑膜炎和关节炎，出现发热、呼吸困难、咳嗽、关节肿胀和部分神经症状。此外，Hps感染猪容易继发或混合感染猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌等其他致病微生物，临床上共染病例多发。各品种和生长阶段的猪均对Hps具有易感性，2～8周龄的仔猪易感性最强，发病率一般为10%～15%，死亡率可达50%以上［1］，给养猪业造成重大经济损失。Hps 血清型较多，有关专家用兔抗血清作免疫扩散试验对不同Hps 菌株的热稳定抗原制剂进行测试，发现存在15个不同的血清型，此外，一些血清型还没有分型。不同血清型菌株之间缺乏交叉保护，存在地区差异，甚至同一地区或猪场其血清型也不尽相同［2］。目前，控制这种疾病的主要方法是接种灭活疫苗，这有许多局限性。例如灭活疫苗并不包含在一个地区传播的所有毒力血清型病毒。长期以来抗生素在防治Hps 中得到广泛应用，起到了积极效果，但是不合理地使用使得Hps 耐药性增强，耐药谱进一步扩大，增加了防治难度。

该试验对从河南长垣市部分养猪场采集疑似感染Hps病死猪的肺脏、脾脏、关节渗出液等组织病料进行Hps常规分离、血清型分型鉴定及PCR检测，并对分离菌株药敏特性试验，为副猪嗜血杆菌流行情况和临床筛选药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无菌采集长垣市部分猪场疑似Hps病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结渗出液等组织病料，共35份。

1.2 主要试剂

胰蛋白大豆琼脂（TSA）培养基，胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基，犊牛血清，烟酰胺嘌呤二核苷酸（NAD），微量生化鉴定试剂管，抗生素药敏纸片，HPs 1～15型标准血清试剂盒。

1.3 主要仪器

无菌操作台，高速台式冷冻离心机，水浴恒温（摇床）振荡器，CO2培养箱，高压蒸气灭菌锅，PCR扩增仪。

1.4 细菌纯化培养及镜检

用无菌接种环挑取少许病料接种于TSA平板培养基，置于5%CO2培养箱，37 ℃培养48 h 后，再挑取疑似Hps典型菌落接种TSA平板，继续进行37 ℃、24 h纯培养。挑取菌落制作涂片，革兰氏染色，显微镜下观察其形态学特征。

1.5 细菌NAD依赖性试验

挑取单菌落分别接种于营养肉汤、普通琼脂、血琼脂平板（含0.1%NAD）、TSA 平板（不含小牛血清和NAD）和TSB 培养基（含小牛血清和NAD），置于5% CO2培养箱，37 ℃培养24～48 h，观察细菌不同培养基上生长情况与菌落特征。

1.6 生化鉴定

挑取纯化培养的单个菌落分别接种含有5%的无菌胎牛血清1 μl 和20% NAD 1 μl 的微量生化鉴定管，置于5%CO2培养箱，37 ℃培养24 h。过氧化氢酶试验：在载玻片上将1滴3%的H2O2溶液和挑取少许的纯培养菌落充分混合均匀，观察是否产生气泡。氧化酶试验：将氧化酶试剂直接滴在备检菌落上，观察结果。

1.7 血清型分型鉴定

参考徐引弟等［3］报道的琼脂扩散试验方法进行血清分型。取纯化培养菌落，以PSB缓冲液稀释，8 000 r/min，离心3 min，弃去上清液，再加入PSB 缓冲液，高压灭菌，8 000 r/min，离心3 min，即得分离菌株的分型抗原，用于琼脂扩散试验Hps血清分型鉴定。

1.8 PCR鉴定

采用水煮法提取分离菌基因组DNA，挑取单个菌落加入装有100 μl 双蒸水的离心管内，混匀，沸水浴10 min后，-20 ℃冰浴10 min，于4 ℃、10 000 r/min离心3 min，取上清液作为DNA 模板备用。根据Hps 16S rRNA 序列设计引物，预期扩增目的基因片段大小822 bp。PCR 扩增反应体系为20 μl：2×Master Mix 10 μl，DNA模板2 μl，上、下游引物各1 μl，补足DEPH 水至20 μl。PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。取10 μl目的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.9 药敏试验

应用美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的K-B 琼脂纸片法，检测分离菌株对11 种抗生素的敏感性，按照CLSI标准结果判定，抑菌圈直径＞30 mm 为敏感（S）、20～30 mm为中介（I）、＜20 mm为耐药（R）。

2 结果

2.1 细菌纯化培养及镜检

分离菌在TSA培养基上长出表面光滑隆起、圆形、湿润、边缘整齐、灰白色的菌落，大小为0.5～2 mm。革兰氏染色为革兰氏阴性短小菌，菌体呈单个的球状、细长杆状、丝链状，形体多样化。

2.2 细菌NAD依赖性试验

分离菌营养肉汤、普通琼脂、TSA平板（不含小牛血清和NAD）培养基上均未见菌落生长，而在TSB培养基（含小牛血清和NAD）血琼脂平板（含0.1%NAD）长成半透明、露珠状菌落，无溶血现象，且在含有NAD的TSB培养基中生长良好，表明分离菌生长需要NAD。

2.3 生化鉴定结果

分离菌氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性；H2S、脲酶、靛基质试验为阴性；发酵葡萄糖、蔗糖，产酸不产气；不发酵赖氨酸、甘露醇。有23株分离菌符合Hps生化特征。

2.4 血清分型鉴定

血清分型试验结果发现，在23株Hps分离菌中，有Hps血清1型7株，血清4型11株，血清5型2株，未定型3株。

2.5 PCR鉴定结果

利用特异性引物对分离菌株基因组进行PCR 扩增，得到一条长为822 bp 特异性条带，符合预期扩增目的大小，见下图。综合细菌培养特性、镜检、生化特性以及PCR鉴定结果，可判断分离菌为Hps。

图 分离菌株16S rDNA PCR 检测结果

2.6 药敏试验结果

药敏试验结果表明，23株分离菌对头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟敏感性较强，对其他抗生素均有不同程度耐药性，其中对诺氟沙星、复方新诺明、磺胺嘧啶耐药性最强，耐药率分别为69.57%（16/23）、65.22%（15/23）、69.57%（16/23），见下表。

表 23株分离菌对抗生素敏感性检测结果

3 讨论

该次研究对来自长垣市部分猪场疑似副猪嗜血杆菌病死猪的35 份病料进行细菌分离纯培养、镜检、生化试验以及PCR 鉴定，共得到23 株Hps，通过血清型鉴定，23株Hps血清分属于1、4、5血清型及未定型血清，其中优势血清型为1 型占30.43%（7/23）和4 型占47.83%（11/23）。蔡旭旺等［4］报道，我国猪场Hps 优势流行菌株血清型主要为4、5、12 和13 型。该次血清型的鉴定可为今后Hps疫苗研制、菌株血清型的选择提供参考。研究表明，长垣市Hps 在猪场普遍存在，血清型比较多样化，流行菌株复杂，应引起重视。Hps 具有兼性厌氧和V 因子依赖性生长的特点，其分离培养条件比较特殊。Hps 对营养要求很高，初次分离培养需要供给5%～10%的CO2促进生长，且其生长需要V因子［5］。此外，病料采集尽量来自未使用抗生素治疗的病猪和死亡时间在12 h 以内的病死猪。

不同地区、不同血清型Hps 菌株对同一类抗生素的敏感性有所差异。药敏试验可以检测不同Hps 菌株对抗生素的敏感性，以便了解当地抗生素治疗效果，为临床合理使用抗生素提供参考依据。目前，Hps 疫苗接种和抗生素是防控该病的主要有效措施，但是疫苗菌株与田间流行株存在差异，缺乏交叉保护，有可能导致免疫失败。抗生素长期滥用引起耐药性增强以及细菌耐药机制发生变化，使得抗生素选择压力越来越大。该研究中23 株分离菌对大多数抗生素均有耐药性，仅对头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟敏感性较强。这可能与治疗Hps 病选用抗生素有关，也可能与菌株在适应环境生存中产生新的变异株有关。建议选用敏感性强的抗生素进行防治，且交替使用抗生素，避免耐药菌株发生。