羊李氏杆菌病的鉴别与检测检疫方法

2023-03-12孙娟山东省聊城市茌平区动物疫病预防控制中心

中国畜牧业 2023年1期

关键词：单增李氏琼脂

文│孙娟（山东省聊城市茌平区动物疫病预防控制中心）

羊李氏杆菌病又被称为转圈病，该病是由单核细胞增多性李氏杆菌感染导致的一种传染性疾病。该病主要通过呼吸道、消化道、受损皮肤等途径感染。该病多为散发，但病死率较高。妊娠期母羊感染后可出现流产症状，羔羊感染后快速死亡。该病对我国养羊业危害巨大。

一、李氏杆菌生物学特性

1.血清型。单增李氏杆菌含有特异性表面蛋白、鞭毛抗原和菌体抗原。目前共发现13种血清型，分别为3a、3b、3c、1/2a、1/2b、l/2e、4a、4b、4e、4d、4ab、4c或7型。其中4b型危害最为严重，占总病例的50%。

2.形态结构。单增李氏杆菌是一种革兰氏阳性菌，菌体形状呈两端钝圆、略弯曲、大小约为0.4～2微米、无芽孢。22℃时可形成鞭毛，具有运动性。随着温度升高至37℃时，鞭毛数量降低至一根，运动性能下降。

3.培养。单增李氏杆菌为兼性厌氧菌，生长环境为1～45℃，通常在35℃条件下活性最强。20～25℃环境下穿刺培养2～5天，其可生长为倒立的伞状。常温条件下培养可通过显微镜观察到细菌在培养基内呈翻转运动。单增李氏杆菌对营养要求较低，可在普通琼脂培养基上正常生长。培养1～2天后，培养基上可生长出轮廓明显的菌落，菌落多呈蓝灰色透明状，阳光斜射可表现出蓝绿光泽。在血液葡萄糖琼脂培养基上培养可形成光滑的圆形菌落，且出现β-溶血环。液体培养基内培养24小时后可出现浑浊现象，连续培养一段时间可观察到沉淀。

4.生化特性。单增李氏杆菌常温下可发酵分解产生葡萄糖、果糖、乳糖等，但无法发酵木糖、甘露醇、阿拉伯糖等。硫化氢、甘露醇、赖氨酸还原试验为阴性，不产生H2S和靛基质，马尿酸钠、过氧化氢、甲基红试验为阳性。

5.抗性。单增李氏杆菌对外界环境适应性较强，可在高温、高渗透压、酸、碱性环境下生存。通常1～45℃内均可生长，且在30～37℃环境下具有较强的活力。同时，可在-0.1～0.4℃中生存，是一种耐冷的病原菌。另外，该病原菌对高温环境耐受性较强，60℃条件下20分钟方可灭活。同时，对酸耐受性强，pH 5.6～9.4范围内均可生长。除此之外，单增李氏杆菌对盐具有较强抵抗力，10%氯化钠条件下可大量生长。病原菌对干燥抵抗性强，可在干燥的日粮中长期存在。但病原菌对酒精、新洁尔灭等消毒剂以及紫外线较为敏感。

二、鉴别

1.剖检变化

（1）脑炎型。对病羊解剖可发现病羊肝肿大，存在弥散性坏死病灶。胃黏膜、肠系膜淋巴结、肝、肾、脾等器官炎症明显，且多有充血或水肿现象。脑积液增多，脑干质地变软。血液和组织中含有较多的多形核细胞，血管周围存在大量坏死灶。

（2）子宫型。对妊娠期病羊解剖可发现胎盘病变明显，且绒毛上皮出现坏死，顶端分泌大量脓性渗出物。子宫内胚胎早期死亡且自溶。淋巴结、胃肠黏膜、气管黏膜等有明显的充血现象，且肝、脾存在大量坏死病灶。

（3）败血型。对病羊解剖可发现病羊脾肿大，存在大量粟状坏死病灶。同时伴有鼻炎、出血性结膜炎、脑膜充血。

2.实验室检查

（1）镜检。无菌条件下采集病死羊肝进行涂片，随后进行染色、镜检可发现该菌为革兰氏阳性菌，菌体两端钝圆，单个或成对相连，无荚膜和芽孢。

（2）分离培养。无菌条件下采集病死羊肝组织样本，将其按照1∶5的比例与生理盐水进行混合，随后研磨并将其分别接种于血液琼脂培养基和肉汤培养基进行培养。其中血液琼脂培养基分别放置于37℃、厌氧和有氧条件下培养1～3天。培养结束后可发现肉汤变浑浊，无气泡产生。血液琼脂培氧基上生长出大量圆形透明菌落，菌落表面光滑，周围有溶血环。透光检查发现菌落为蓝灰色，进一步培养后，蓝灰色菌落逐渐变为灰白色，透明程度降低。挑取可疑菌落进行革兰氏染色，并将其分别接种于0.05%和0.1%的亚蹄酸钾血液琼脂培养基内，放置于37℃条件下培养1～3天，可发现0.05%浓度的培养基上生长出大量灰白色菌落，且菌落经过72小时颜色变为红色。0.1%浓度的培养基内生长大量黑色菌落。若将可疑菌落接种于血清葡萄糖甘油肉汤和10%氯化钠的血清葡萄糖甘油琼脂内，置于37℃条件下培养1～3天，可发现前者混浊，底部出现沉淀物。培养初期震荡培养基，沉淀物呈螺旋状上升，培养后期震荡沉淀成颗粒状。后者培养基内会出现大量圆形透明菌落，菌落表面光滑呈蓝色。培养后期发现菌落逐渐变为不透明的灰白色。

（3）运动性检查。运动性检查也是鉴别单增李氏杆菌的重要方式之一。取血清葡萄糖甘油肉汤纯培养物在半固体培养基内进行穿刺接种，并放置于20℃条件下培养三天。镜检发现菌体可移动，且沿穿刺线生长至两侧呈倒立伞状。或放置于37℃条件下培养三天，发现其菌体运动性能减弱甚至消失。菌体沿穿刺线稍向两侧生长。

三、检测方法

单增李氏杆菌对外界环境具有较强的抵抗力，是目前世界上危害最为严重的病原菌之一，一旦污染日粮会给养殖业带来巨大的损失。近年来随着疫情的不断发生，单增李氏杆菌检测逐渐引起重视。其检测方法也不断向快捷、灵敏、准确方向发展。目前该病原体的检测方式主要分为传统检测、分子生物学检测以及免疫学检测三种。

1.传统检测。单增李氏杆菌传统检测方法主要是将疑似病例采集的样品进行分离培养。随后将培养基上生长的菌落进行生化反应分析，并在显微镜下观察其运动，同时进行溶血实验，最后再进行血清型分析鉴定。传统检测方法灵敏度高、特异性强，可定性、定量检测且检测成本较低，但检测过程较慢，影响检测结果的因素较多。

传统检测方法中美国食品药品管理局的增菌法和冷增菌法是目前国际上公认的有效检测方法之一。增菌法适用于分离乳汁中的病原菌，将样品接种在含放线菌酮的肉汤内进行培养，随后通过划线法分离细菌，细菌在培养基内培养一段时间形成菌落后，提取可疑菌落进行生化反应和血清型鉴定。冷增菌法是将采集的样本置于4℃条件下培养，每7天进行一次细菌分离，连续分离培养两个月。最后，进行病原菌生化反应和血清型鉴定。

我国单增李氏杆菌检测起步晚，目前检测方法包括国标法和小鼠毒力试验两种。上述方法均需增菌和分离提纯，其中小鼠毒力试验法操作简单、快速。

2.免疫学检测。该方法检测原理是依据抗原抗体反应进行检测。检测时采集少量样品即可精确检测出抗原，且检测结果不受基质的影响。免疫学检测方法包括酶联免疫吸附法、胶体金免疫技术、免疫磁珠分离技术等。免疫学检测方法操作简单灵敏性高、特异性强、检测结果易于判断。

（1）胶体金免疫技术。该方法是使用胶体金作为标记物的一种免疫标记技术，主要分为快速免疫层析法和快速斑点金渗滤法。其中快速免疫层析法对李氏杆菌检测灵敏度高达85%以上。通常可使用柠檬酸钠制备胶体金标记单增李氏杆菌抗体免疫层析检测板。

（2）酶联免疫吸附法。酶联免疫吸附法是目前应用最为广泛的一种免疫学检测方法，该方法主要针对鞭毛抗原。酶联免疫吸附法检测李氏杆菌通常2～3小时可出检测结果，PCR联合酶联免疫吸附法可在5小时内检测出10个单增李氏杆菌菌落。酶联免疫吸附法操作简便、易被标准化。

（3）免疫磁珠分离技术。本检测技术主要依据抗原抗体结合的特异性。抗原与抗体结合后利用磁性进行分离，从而获得对富集于微粒上的单增李氏杆菌，为后续检测提供便利。

3.分子生物学检测。常用的分子生物学检测方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、免疫磁珠分离与PCR结合法、基因芯片技术等。

（1）PCR。PCR检测法在单增李氏杆菌检测上广泛应用，检测人员可使用传统的分离鉴定方法以及PCR方法，从而对病原菌进行检测比较。与常规检测法相比，PCR检测法要求较低。另外，PCR检测法还可与其他检测技术相结合，从而有效提高检测灵敏度和特异性，例如高速离心等，同时也可有效降低检测量。

（2）免疫磁珠分离与PCR结合法。免疫磁珠分离与PCR结合法以核酸探针技术为基础，核酸探针技术的应用是单增李氏杆菌分子水平检测的标志技术。可通过利用32P标记探针，从而进行斑点杂交实验。由于其仅与单核李氏杆菌发生反应，因此具有良好的特异性。另外以RNA作为靶点研发的新型探针试剂盒，可大大缩短检测时间提高检测效果。免疫磁珠分离与PCR结合法特异性强，但对检测人员要求较高，操作复杂，因此实际检测过程中应用范围较窄。

（3）基因芯片技术。基因芯片技术是一种革命性技术，该技术基于基因表达和基因功能的研究，又被称为DNA芯片技术。目前该技术可检测6种李氏杆菌，其中单增李氏杆菌检测限为200国际单位/克。基因芯片技术具有高融通、速度快、误差小等特点。但实际检测过程中仍需将病原菌进行纯化富集处理，从而进一步提高检测灵敏度和特异性，富集处理后还需进行PCR检测。