灵仙新苷对膝骨关节炎软骨细胞凋亡和自噬的影响

李纳平 ，涂杜鑫 ，邝高艳 ，刘鑫 ，谭旭仪 ，曾凡 ，卢敏

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410011； 2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年人群常见的慢性退行性关节疾病，其病理特征主要包括关节软骨退变、滑膜炎症、软骨下骨硬化、大量骨赘生成等[1-2]。在OA好发部位中，膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）发病率最高，其次是手关节炎和髋关节炎，我国中老年人群KOA发病率为8.1%，且有不断升高趋势[3-4]。

关节软骨退变被认为是KOA发病最关键的机制，软骨细胞通过维持细胞外基质（ECM）合成与降解的动态平衡，从而在润滑关节、维持关节软骨机械形态方面发挥重要作用[5]，软骨细胞凋亡会打破关节软骨合成与降解的稳态平衡。自噬是细胞维持内稳态的关键机制，细胞通过自噬降解和再利用细胞中衰老的细胞器和大分子物质，从而避免直接死亡。研究发现，软骨细胞自噬和KOA发生密切相关，通过激活自噬可以减少软骨细胞凋亡，延缓关节软骨退变[6-7]。中医药治疗KOA具有多途径、多靶点的特点，且不良反应少，能有效缓解KOA症状，延缓软骨退变[8]。

中药威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.或东北铁线莲Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根茎，具有祛风湿、通经络、止痹痛作用[9]，其三萜皂苷类成分在治疗类风湿关节炎和KOA方面具有一定疗效[10]，能通过抑制软骨细胞凋亡[11]，维持ECM稳定[12]，从而延缓KOA关节软骨退变。灵仙新苷（clematichinenoside AR，C-AR）是从威灵仙中提取的一种三萜皂苷，具有抗炎镇痛作用，能将关节炎大鼠血清和尿液24种类风湿关节炎相关标志物调至正常水平，缓解关节炎症状[13]，并可通过激活自噬减轻氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7细胞炎症[14]。但其能否治疗KOA目前尚无报道。基于此，本研究观察C-AR对KOA软骨细胞凋亡和自噬的影响，为KOA治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 样本来源

KOA关节软骨样本来自湖南中医药大学第一附属医院四肢关节科2021年1月－2021年12月接受全膝关节置换术的KOA患者。共14名患者，其中女性11名，男性3名，平均年龄（69.71±6.28）岁。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理审查委员会批准（HNLL-2021-006-01），并获得所有患者书面知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

灵仙新苷，货号L-151，成都瑞思芬；DEME/F12、胎牛血清（FBS），货号分别为11330032、10099，美国Gibco公司；活性氧（ROS）试剂盒、胰蛋白酶，货号分别为S0033S、C0201，上海碧云天；Ⅱ型胶原酶，货号9001-12-1，美国Sigma公司；白细胞介素（IL）-1β，货号200-01B，美国Peprotech公司；IL-6、IL-8 ELISA检测试剂盒，货号分别为CSBE04638h、CSB-E04641h，武汉华美生物工程；BCA蛋白定量试剂盒，货号10030908，长沙艾碧维；PBS、RIPA裂解液，货号分别为G4202、G2002，武汉赛维尔；CCK8试剂盒，货号NU679，日本同仁；Trizol总RNA提取试剂，货号15596026，美国Thermo；HiFiScript cDNA Synthesis Kit，货号CW2569，北京康为生物；甲苯胺蓝染液，货号BL539A，北京索莱宝；DAPI染色液，货号C02-04002，北京Bioss；Ⅱ型胶原一抗，货号AF0135，美国Affinity Biosciences；Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3B一抗，货号分别为50599-2-Ig、19677-1-AP、11306-1-AP、18725-1-AP，美国Proteintech；Bcl-2一抗，货号ab59348，英国Abcam；HRP-goat anti-mouse IgG、HRP-goat antirabbit IgG，货号分别为SA00001-1、SA00001-2，美国Proteintech。SW-CJ-2FD超净工作台，江苏苏净；HERAcell2401二氧化碳培养箱，美国Thermo；XDS-3倒置生物显微镜，上海奥显；Enspire多功能酶标仪，美国Perkinelmer；LSM800激光扫描共聚焦显微镜，德国蔡司；Aria Ⅱ流式细胞仪，美国BD；MB-530酶标仪，深圳汇松。

1.3 细胞分离、培养及鉴定

参考文献[15]采用二步酶消化法提取软骨细胞，将软骨组织剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱消化30 min，加入完全培养基（79% DMEM/F12+20% FBS+1%双抗）终止消化。将软骨组织转移至离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，加入与软骨组织等体积的0.2% Ⅱ型胶原酶，转移至无菌玻璃瓶，置于培养箱消化20 h。用70 μm细胞过滤器过滤，滤液1 200 r/min离心5 min，去除上清液，沉淀即为软骨细胞。用完全培养基重悬细胞，接种至培养瓶，3～5 d换液1次，待细胞铺满瓶底80%以上后进行传代。取P1代细胞进行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定。

1.4 分组、造模及给药

将软骨细胞按1×105个/孔接种至6孔板，加入完全培养基，置于培养箱培养过夜。将细胞分为对照组、模型组和C-AR组，每组4个复孔，对照组正常培养，模型组参考课题组前期方法[16]加入10 ng/mL IL-1β处理24 h，C-AR组参照文献[17]方法，先加入30 μmol/L C-AR预处理1 h，然后加入10 ng/mL IL-1β处理24 h。

1.5 CCK8法检测细胞活力

将软骨细胞以1×104个/孔接种至96孔板，使用完全培养基置于培养箱中培养24 h，然后换成无血清培养基继续培养12 h，按“1.4”项下方法分组并进行干预，吸去培养基，每孔加入100 μL CCK8工作液（用PBS按1∶9稀释），放入培养箱避光孵育2 h，酶标仪波长450 nm处检测各孔吸光度（OD值）。

1.6 ELISA检测

将细胞按“1.4”项下方法处理后，吸去培养基，加入预冷PBS洗涤细胞，将细胞转移至离心管中，加入PBS，超声破碎细胞，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，取上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测细胞IL-6和IL-8含量。

1.7 流式细胞仪检测活性氧含量

按“1.4”项下方法处理细胞后，PBS洗涤细胞2次，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，无血清培养基洗涤细胞3次，收集细胞，使用流式细胞仪检测ROS含量。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率

按“1.4”项下方法处理细胞后，胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移至离心管，2 000 r/min离心5 min，沉淀用PBS洗涤2次，每次洗涤后2 000 r/min离心5 min，向样品中加入结合缓冲液490 μL、Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL，室温避光反应10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 Western blot检测

将细胞按“1.4”项下方法处理后，吸去培养基，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。蛋白进行琼脂糖凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Bax一抗（1∶5 000）、Caspase-3一抗（1∶1 000）、Bcl-2一抗（1∶500）、Beclin1一抗（1∶1 000）、LC3B一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜。加相应二抗，室温孵育90 min，ECL发光液显影，凝胶成像系统成像。用Image-Pro Plus 6.0软件对条带进行灰度分析，以β-actin为内参，计算蛋白相对表达量。

1.10 qRT-PCR检测

将细胞按“1.4”项下方法处理后，吸去培养基，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，根据HiFiScript cDNA Synthesis Kit，以总RNA为模板反转录合成cDNA，SYBR法对样品进行qRT-PCR。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.11 免疫荧光检测

将爬片放入6孔板中，以1×105个/孔接种细胞，按“1.4”项下方法处理。4%多聚甲醛固定30 min，加入0.3%Triton X-100，37 ℃通透15 min，5% BSA 37 ℃封闭10 min，加入LC3B一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜。滴加山羊抗兔IgG（1∶100），室温避光孵育20 min，DAPI工作溶液染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件计算荧光强度。

1.12 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。实验数据以±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞鉴定

初期软骨细胞呈不规则多角形或短梭形，随着培养时间延长，形态多呈长梭形，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞间有伪足相连，形态似成纤维细胞。甲苯胺蓝染色可见胞浆呈浅蓝色，细胞核为深蓝色。Ⅱ型胶原免疫荧光染色显示，胞浆及胞膜呈绿色荧光，表明培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，细胞核被DAPI复染，呈蓝色。见图1。

图1 人KOA软骨细胞形态观察及鉴定（×200）

2.2 灵仙新苷对软骨细胞活力的影响

与对照组比较，模型组细胞活力显著降低（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞活力显著升高（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组软骨细胞细胞活力比较（±s）

表2 各组软骨细胞细胞活力比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

组别对照组模型组C-AR组n 4 4 4细胞活力1.60±0.07 0.97±0.04**1.31±0.04#

2.3 灵仙新苷对软骨细胞白细胞介素-6和白细胞介素-8表达的影响

与对照组比较，模型组细胞IL-6和IL-8含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞IL-6和IL-8含量显著减少（P<0.05）。结果见表3。

表3 各组软骨细胞IL-6和IL-8含量比较（±s，pg/mL）

表3 各组软骨细胞IL-6和IL-8含量比较（±s，pg/mL）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

组别对照组模型组C-AR组n4 4 4 IL-6 23.87±4.62 44.01±3.68**33.25±6.10#IL-8 57.79±5.48 97.10±6.26**83.92±3.68#

2.4 灵仙新苷对软骨细胞活性氧含量及凋亡率的影响

与对照组比较，模型组细胞ROS含量显著增加，凋亡率显著升高（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞ROS含量显著减少，凋亡率显著降低（P<0.01）。结果见图2、图3、表4。

图2 各组软骨细胞ROS检测

图3 各组软骨细胞凋亡率检测

表4 各组软骨细胞ROS含量和凋亡率比较（±s）

表4 各组软骨细胞ROS含量和凋亡率比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组C-AR组n4 4 4 ROS荧光强度1 292±241.7 6 197±154.3**3 410±135.7##凋亡率/%4.19±0.26 25.86±0.59**17.35±0.97##

2.5 灵仙新苷对软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞Bax和Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞Bax和Caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.01）。结果见图4、表5。

表5 各组软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表5 各组软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组C-AR组n 4 4 4 Bax/β-actin 0.24±0.03 0.57±0.03**0.32±0.03##Bcl-2/β-actin 0.55±0.03 0.15±0.03**0.30±0.03##Caspase-3/β-actin 0.19±0.02 0.54±0.06**0.32±0.05##

图4 各组软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印迹

2.6 灵仙新苷对软骨细胞凋亡相关mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组细胞Bax和Caspase-3 mRNA表达显著升高（P<0.01），Bcl-2 mRNA表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞Bax和Caspase3 mRNA表达显著降低（P<0.01），Bcl-2 mRNA表达显著升高（P<0.01）。结果见表6。

表6 各组软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较（±s）

表6 各组软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组C-AR组n 4 4 4 Bax 1.00±0.06 5.33±0.29**2.84±0.35##Bcl-2 1.00±0.06 0.26±0.01**0.55±0.06##Caspase-3 1.00±0.07 3.49±0.21**2.12±0.21##

2.7 灵仙新苷对软骨细胞自噬相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与对照组比较，模型组细胞Beclin1蛋白表达和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著降低（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞Beclin1蛋白表达和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著升高（P<0.01）。免疫荧光结果显示，与对照组比较，模型组细胞LC3B表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，C-AR组细胞LC3B蛋白表达显著升高（P<0.01）。结果见图5、图6、表7。

图5 各组软骨细胞Beclin1、LC3B蛋白免疫印迹

图6 各组软骨细胞LC3B阳性表达（免疫荧光染色，标尺＝25 μm）

表7 各组软骨细胞Beclin1、LC3B蛋白表达比较（±s）

表7 各组软骨细胞Beclin1、LC3B蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01，与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组C-AR组Beclin1/β-actin 0.43±0.04 0.24±0.03**0.38±0.02##LC3BⅡ/LC3BⅠ2.22±0.06 0.42±0.03**0.93±0.04##LC3B荧光强度67 452±2 138 44 023±2 371**57 225±1 563##

3 讨论

威灵仙是治疗风湿痹痛的要药。现代研究发现，威灵仙提取物及有效成分在治疗KOA方面均能发挥积极作用[18]。马勇等[19]运用威灵仙提取物对体外培养的兔膝关节软骨细胞进行干预，发现其能促进软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA的表达，对关节软骨产生保护作用，从而延缓KOA发展。此外，威灵仙提取物还能促进软骨细胞ECM合成，维持软骨细胞表型稳定[20]。本课题组前期研究发现，在独活寄生汤基础上加入威灵仙、黄芩等药物能降低KOA兔血清及关节液炎症因子表达，缓解软骨退变[21]。体外实验能通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制膝关节软骨细胞凋亡[22]。

C-AR作为威灵仙中一种三萜皂苷类成分，在抗炎、抗氧化应激方面具有一定作用。炎症反应贯穿KOA发病过程，促炎因子如IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α等在KOA发病过程中大量释放，导致产生疼痛。软骨细胞异常的氧化应激状态也会诱发炎症因子产生[10]，从而进一步加速软骨细胞凋亡。研究发现，C-AR能降低TNF-α刺激下MH7A细胞IL-6和IL-8分泌，减少基质金属蛋白酶产生，有效拮抗TNF-α诱导的炎症和细胞毒性[17]。本研究发现，IL-1β刺激导致软骨细胞活力降低，细胞IL-6和IL-8含量明显增加，氧化应激水平也随之升高，细胞凋亡率明显升高。C-AR处理后，软骨细胞活力升高，细胞IL-6和IL-8含量明显减少，氧化应激水平和细胞凋亡率明显降低，促凋亡Bax、Caspase-3基因和蛋白表达下调，抗凋亡Bcl-2基因和蛋白表达上调。提示C-AR可减轻体外培养的KOA软骨细胞炎症和氧化应激反应，抑制细胞凋亡。

自噬可恢复受损软骨细胞功能，减少软骨细胞凋亡，延缓KOA发生发展[23]。课题组前期研究发现，牛膝多糖能促进软骨细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达，抑制凋亡相关蛋白Fadd、Caspase-3/9表达，降低软骨细胞凋亡率[24-25]，提示可通过促进软骨细胞自噬抑制软骨细胞凋亡。本研究结果显示，C-AR组软骨细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高，表明C-AR能促进自噬发生。结合细胞凋亡率可见，软骨细胞凋亡与自噬水平呈负相关，随着自噬增强，凋亡进一步减弱。

综上所述，C-AR可减轻体外培养的KOA软骨细胞炎症和氧化应激反应，抑制软骨细胞凋亡，其机制可能与激活自噬有关。本研究初步观察了C-AR对KOA软骨细胞自噬和凋亡的影响，对其通过哪些途径激活自噬、抑制细胞凋亡及量效关系尚未明确，今后我们将继续深入研究，为防治KOA提供更多依据。