食用菌培养料发酵过程中理化性质及微生物群落结构研究

2023-03-10赵玉阳周金看夏会楠李东晓郑素月王春霞

食药用菌 2023年4期

赵玉阳周金看夏会楠李东晓郑素月王春霞

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸 056038）

食用菌味道鲜美、营养丰富，还具有保健和药用价值，备受消费者青睐。近年来，在精准扶贫、大健康产业、乡村振兴和“一带一路”战略等方针政策背景下，食用菌产业迎来了前所未有的良好发展机遇，产业规模发展迅速。目前食用菌产业已是中国农业产业中继粮食、蔬菜、果树、油料之后的第五大产业，产量占世界总产量的70%以上，中国成为世界上最大的食用菌生产国和消费国。

食用菌培养料发酵是通过温度、湿度、氧气等环境调控，为培养料中有益微生物创造良好生态，促进其生长繁殖，使培养料逐渐腐熟，积蓄食用菌所需营养物质并消除有害生物的过程。培养料发酵影响培养料质量，而培养料质量好坏关系食用菌产量与品质高低。在实际生产中，双孢蘑菇、草菇、姬松茸等通常采用发酵料栽培。如，李文华[1]研究发现姬松茸在生产上一般采用发酵料栽培，其利用培养料中的微生物对基质进行降解转化，获得生长发育所需营养。忻龙祚[2]认为双孢蘑菇的培养料经过高温好氧发酵，使得原料中的大分子物质降解为小分子物质，更利于双孢蘑菇菌丝利用。杨小兵等[3]研究发现在草菇生产中，培养料发酵栽培能够提高其产量，期间利用机械通风还可以缩短发酵时间。此外，龚凤萍等[4]对比研究了生料、灭菌料、发酵料、发酵后熟料等4 种不同处理方式培养料对平菇生长的影响，结果以发酵后熟料的发菌成功率最高，为100%，生物学效率高达82.67%。黄保成等[5]探究以桉树木屑为主料，发酵不同时间后栽培灵芝的效果发现，发酵4 天、8 天后的培养料栽培灵芝，菌丝生长旺盛、发菌成品率高，且出芝整齐、生物学效率高。

研究食用菌培养料发酵过程中的理化性质及微生物群落结构的变化及演替规律，不仅能够为改进并开发新的培养料发酵技术提供更加科学的理论依据与数据支撑，而且对实际生产中的原材料选择调整、培养料配方优化等具有重要的指导意义。

1 食用菌培养料发酵过程中温度、含水率、pH 和电导率的变化

食用菌培养料发酵过程极为复杂，温度、含水率、pH 等是影响发酵效果的重要因素，也是控制发酵参数的关键指标，直接影响发酵时间及发酵料质量。在培养料发酵进程中，这些理化指标处于不断动态变化中，最终用于判定培养料是否适宜食用菌生长发育，同时对微生物群落的动态变化起决定性作用[6]。通过调节理化性质可以控制微生物群落组成，提高发酵料的氧化还原能力[7]。张昊琳等[8]研究发现培养料发酵过程中其理化性状直接关系到双孢蘑菇的品质和产量，也影响菌丝对培养料的选择。姬快乐等[9]研究发现在大球盖菇培养料中添加玉米浆会改变其理化性质，使发酵温度上升更快，高温期更长，并且在一定程度上促进氮循环，更有利于秸秆腐熟发酵。

1.1 温度

温度是培养料发酵过程最直观、最重要的控制参数，能够反映不同阶段微生物的代谢活性，也是决定发酵料质量好坏的重要因素。温度过高或过低都不利于发酵的顺利进行，同时也制约着有机质的分解、酶的活性及微生物活性等。培养料发酵过程中温度的升高不仅可以提高多种酶活性，还可以结合有益微生物的拮抗作用共同实现致病菌的灭活[10]。研究发现，在培养料发酵过程中，温度的变化一般呈先上升后下降的趋势，通常可划分为升温、高温、降温3 个阶段；料堆温度会在最初3 天急剧上升，这是因为培养料中的有机物在微生物的分解下释放热量，且培养料中的大部分物质对热量的传导性不佳所致[11]。Dias 等[12]研究表明发酵料降温阶段的温度下降是由于随着堆体中易被降解的物质逐渐减少，微生物代谢繁殖的营养不足，从而导致微生物的代谢活动减弱所致。

1.2 含水率

含水率是推动培养料发酵进程的一个重要因素，一方面有机物氧化分解产生水分，会造成发酵料中含水率增加，另一方面水蒸气挥发及被微生物利用又会导致含水率下降[13]。含水率过低会不利于微生物的生长代谢；含水率过高则不利于通风，导致厌氧发酵。李月明[14]以玉米芯和牛粪为主料优化巴西菇发酵料，培养料发酵过程中含水率整体呈下降趋势，培养料起始含水量宜在50%～60%，发酵过程宜在60%～70%。张永泽[15]认为在发酵前期，物料中易被微生物分解利用的有机物较多，且初期产热量较高，大部分水分会得到蒸发，因此含水率在发酵前期下降较快；之后微生物的代谢活性下降，对水分的利用减少导致含水率下降速率减缓，最后趋于稳定。Kong 等[10]研究发现在培养料发酵过程中适当降低含水率会增加发酵料的孔隙率，从而保持充足的氧气提高微生物活性，加速有机物的降解。

1.3 pH

在培养料发酵过程中pH 会随着物料中有机质的降解发生变化，微生物在中性偏碱的环境下活性良好、代谢旺盛，pH 过高或过低都不利于其生长代谢[8]。培养料发酵前期pH 呈下降趋势，这是由于培养料中的糖类、脂类等被降解生成草酸、苹果酸、乳酸、乙酸等小分子有机酸所致[16]。李文华[1]研究发现巴西菇有粪培养料在发酵过程中pH 升高的原因是发酵料中微生物将有机物转变为有机酸，而有机酸也在不断地被分解，最后含氮的有机物被分解为氨气，从而使pH 上升。Li 等[17]研究发现培养料发酵初期小分子有机酸和有机物质持续被微生物降解利用，形成铵态氮并释放NH3，使pH 不断升高。高温期后，大量CO2溶解于水中，以及NH3挥发减少，使pH 开始下降，最终趋于稳定。

1.4 电导率

电导率（Electrical Conductivity，EC）表示物质传导电流的能力，对于培养料则代表其可溶性盐的含量，是判断发酵料腐熟的标准[18]。Henry 等[19]研究发现木质纤维素发酵早期EC 值呈下降趋势，这可能与有机酸被微生物分解、氨的挥发及矿物离子的沉淀有关；后期EC 值增加可能是由于有机物的分解释放出大量小分子物质和氨离子等导致盐类离子浓度增加。康健[20]研究发现畜禽粪便堆肥过程中电导率呈先降后升再降的趋势，通过分析认为电导率升高是因堆体中有机物的分解、矿化产生大量无机离子所致；EC值下降则是由于随着NH3的挥发及微生物的利用，可溶性无机盐不断减少而造成的。李月明[14]发现玉米芯牛粪培养料发酵过程中EC 值不断升高，这是由于在发酵过程中有机物被分解成大量的小分子物质，其中各种阴、阳离子及小分子有机酸的存在导致了电导率上升。

2 培养料发酵过程中的营养变化

不同种类食用菌对营养物质的需求基本一致，通常包含碳源、氮源、无机盐（矿质元素）和生长因子（维生素）四大类。其中，碳源是构成食用菌细胞和代谢产物骨架的营养来源，也是食用菌生命活动所需能量的主要来源；氮源是合成食用菌细胞蛋白质和核酸的关键原料。食用菌生长发育过程中不仅需要足够的碳源与氮源，而且还要求碳、氮之间有一恰当的比例，即适宜的碳氮比。

2.1 有机质

有机质降解情况是培养料发酵效果好坏的重要指标之一，微生物为了自身生长需求将培养料中的有机质选择性地进行分解，使得有机质含量随着堆肥过程的持续推进而逐渐降低[21]。培养料发酵过程中，有机质含量一般呈现下降趋势，直至最后趋于平稳状态，其主要原因是有机质为微生物生长代谢的能量来源，微生物会对其进行持续的分解利用，升温阶段有机质降解速度最快，进入高温阶段后，可能是料堆温度升高使微生物的活性降低，且发酵后期残留的大部分营养物质为难降解的有机物，导致微生物降解有机质的速度减慢[8,22-24]。

2.2 总氮

氮是细胞中氨基酸、蛋白质和核酸的关键成分，主要分为硝态氮与铵态氮，其中铵盐比硝酸盐更容易被食用菌吸收利用，对双孢蘑菇菌丝生长和产量形成至关重要[24]。吴一凡等[25]发现添加适量的氮素能够促进竹屑培养料发酵腐熟，显著提升大球盖菇的蛋白质和多糖含量。吴娟[26]认为猪粪发酵过程中氮素的主要损失形态为NH3，占到总氮损失的75%～82%，其次是N2O 和N2。应正河等[27]研究认为双孢蘑菇培养料发酵过程中氮含量上升的现象是由于微生物生长代谢分解有机物以及微生物繁殖增长导致的。李月明[14]研究发现巴西菇培养料发酵过程中氮含量呈上升趋势，主要是由于发酵过程中微生物生长代谢旺盛，使培养料固形物的损失速率大于氮素的挥发速率，因此培养料中全氮含量相对升高。

2.3 碳氮比

食用菌菌丝生长阶段对氮素的需求较高，碳氮比宜为15～20∶1，含氮量低菌丝生长缓慢；子实体发育阶段培养料碳氮比宜30～40∶1，含氮量过高会抑制子实体的形成及生长。碳氮比（C/N）是控制培养料发酵的一个重要参数，直接影响发酵料的质量。易荣菲[28]发现牛粪发酵过程中C/N 呈下降趋势，由于全氮变化在发酵过程中较稳定，因此C/N 的变化规律与碳的变化规律一致。蒋宁等[29]发现用于草菇栽培的菌渣培养料发酵过程碳氮比逐渐下降，说明培养料发酵过程中微生物的大量繁殖有效促进了有机物的降解。刘顺杰等[18]研究指出在草菇培养料发酵期间，其C/N 在一次发酵时显著下降，之后趋于稳定，表明一次发酵时期微生物的繁殖代谢极大促进了有机物的降解。

3 培养料发酵过程中的物质变化

食用菌生产离不开秸秆资源，而植物秸秆的主要组成成分为木质纤维素（Lignocellulose）。木质纤维素主要由纤维素（Cellulose）、半纤维素（Hemicellulose）和木质素（Lignin）组成，是发酵中不易降解的有机质[30]。杨容容[31]指出新鲜木屑中的木质细胞不会完全死亡，木质纤维素等大分子物质没有得到降解直接使用时不易被食用菌菌丝分解和吸收。而发酵的目的就是破坏阻碍降解的秸秆表层结构，把半纤维素、纤维素和木质素等物质转变成食用菌能够利用的营养成分。

3.1 纤维素

纤维素是一种十分常见的多糖，也是植物细胞壁的主要组成成分之一，其基本组成单位为纤维二糖。研究发现，双孢蘑菇培养料发酵过程中纤维素被大量利用，含量显著下降[32]。Ma 等[33]认为发酵过程中纤维素的损耗速率低于半纤维素与木质素，这可能与半纤维素、木质素包裹在纤维素周围，二者优先被降解有关。刘顺杰等[18]发现草菇培养料发酵过程中纤维素含量不断下降，在二次发酵期间显著降低，表明微生物对纤维素的利用主要集中于发酵后期。

3.2 半纤维素

半纤维素的分子量比纤维素小，通常是木质纤维素中最容易被降解的基质，其水解产物主要有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和少量乙酸等[34]。马超凡[35]研究发现在培养料发酵升温阶段，半纤维素的降解率最高，这可能与该阶段微生物代谢活动强有关，进入降温阶段后，半纤维素降解率逐渐平稳。高晓静等[36]研究表明双孢蘑菇培养料二次发酵过程中半纤维素利用率在40%～60%，同时在菌丝生长和出菇期间半纤维素也被持续利用。吴娟[26]报道猪粪堆肥发酵期间半纤维素含量不断减少，分解速率相对较快，这是因为能够降解纤维素的微生物，大部分也能分解半纤维素，通常在纤维素被分解前半纤维素已被消耗。

3.3 木质素

木质素结构复杂且很难被水解，但微生物能在一定程度上使木质素结构发生变化，成为可溶于水的产物。郁红艳[37]发现随着发酵的进行木质素不断被利用，高温期是木质素被降解的快速时期，而降温期木质素的降解速率逐渐减缓；进入二次发酵后期，木质素降解速率再次加快。但也有研究表明，双孢蘑菇培养料发酵期间主要利用的是纤维素与半纤维素，而在菌丝生长和原基形成阶段则以木质素消耗速率最高[38]。吴娟[26]指出堆肥发酵过程中木质素的降解速率低于纤维素和半纤维素，可能与木质素较难被微生物利用有关。

4 培养料发酵过程中酶活性变化

食用菌培养料发酵的本质是微生物不断分泌酶将有机物转化成稳定的腐殖质的过程，因此整个发酵过程需要多种酶的参与。李晓博等[38]在研究培养料不同发酵阶段和接种双孢蘑菇后不同生长阶段的酶活性变化中发现，发酵过程木质纤维素的降解受酶活性的影响，需要经相应的酶分解成葡萄糖、果糖等小分子化合物后才可以直接被双孢蘑菇吸收利用。Kong 等[10]研究表明木聚糖酶对半纤维素的降解至关重要。

4.1 纤维素酶

纤维素能在纤维素酶的作用下将低分子葡聚糖分解为葡萄糖，被微生物直接吸收利用供其生长繁殖。研究表明，双孢蘑菇培养料发酵过程中纤维素酶活性较稳定，但可能受到温度下降的影响，纤维素酶活性在二次发酵时期有显著下降，一潮菇时复又迅速达到峰值[30]；草菇培养料发酵过程中纤维素酶活性不断升高，在原基形成期达到最大值，而后开始下降，表明培养料中纤维素酶的表达主要集中于原基形成期前[39]。

4.2 木聚糖酶

半纤维素的降解是一个复杂过程，需要多种半纤维素酶的协同作用，其中木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶。姚琴[40]研究显示，在双孢蘑菇培养料发酵过程中木聚糖酶活性呈上升趋势，说明在整个发酵过程中木聚糖酶均保持较高的活力。刘顺杰等[18]研究发现草菇培养料在发酵过程中木聚糖酶活性同样呈升高趋势，可能是微生物在发酵中耗尽大部分有机质之后，只能通过分泌大量的酶来分解木质纤维素，从而维持其代谢需求。李晓博等[38]研究则显示，双孢蘑菇培养料发酵过程中木聚糖酶活性呈先上升后下降趋势，在第2 次翻堆时酶活性达到最高，后期酶活性下降的原因可能是温度过高导致微生物活性降低，从而使酶合成减少[36]。

4.3 漆酶

漆酶是一种酚氧化酶，可以催化和氧化许多芳香族化合物，它是木质素降解酶系统的一员，可以通过不同类型铜离子催化氧化酚类及其衍生物，生成酚醛类化合物，在木质素降解和腐殖质形成中发挥关键作用。有研究发现，双孢蘑菇培养料发酵过程中几乎不表现漆酶的活性，在菌丝长满至一潮菇时漆酶活性显著提高[30]；草菇培养料发酵过程中漆酶活性也几乎为零，可能是高温导致漆酶活性丧失，其活性在原基形成期开始升高[39]。

5 培养料发酵过程中微生物群落结构变化

培养料发酵过程中微生物演替规律通常为细菌—放线菌—真菌，微生物各菌群以一定的规律共存，同时又具有各自明显的营养及代谢类型。一些细菌和真菌可以提高发酵料的生产力并抑制病原菌的传播，也可促进食用菌菌丝的生长，诱导子实体的形成[41]。

5.1 细菌

在培养料发酵过程中，细菌的丰度远高于真菌，是降解有机物和提升料堆温度的主要微生物群落。与真菌相比，细菌具有适应恶劣环境的优势[42]。姚琴[40]发现双孢蘑菇培养料发酵过程中放线菌数量不断上升，与漆酶、木聚糖酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等酶活性呈正相关，在培养料发酵腐熟中发挥着重要作用。曹娜等[43]研究表明，发酵时间加长可以增加放线菌的丰度，并且放线菌可以通过分泌β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等水解酶来降解木质纤维素等较难降解的有机物。

5.2 真菌

真菌在培养料发酵过程中能分泌多种胞外酶分解有机质，同时由于其菌丝具有机械穿透能力，可以对发酵料产生一定的物理破坏作用，从而促进有机质的降解[44]。Zhao 等[45]研究发现真菌是发酵料内残留物分解的关键参与者，分泌的多种胞外酶能够有效降解木质纤维素等。真菌群落组成在发酵初始阶段和发酵完成后极为相似，发酵过程中以子囊菌（Ascomycota）为主。Liang 等[46]研究发现培养料发酵过程中真菌群落结构较为稳定，子囊菌门是唯一的优势门，尤其在高温阶段占比最大，表明子囊菌在木质纤维素降解过程中占据主导地位。