多发性骨髓瘤/浆细胞白血病差异表达基因生物学功能、关键基因表达水平及其与预后的关系

常慧娟，孟夜，朱玉榕，班燕芳，章建国，王芝涛，秦慧

安徽医科大学第二附属医院，合肥 230601

多发性骨髓瘤（MM）是血液系统第2 常见恶性肿瘤［1］，其进展是一个多步骤的过程，起初是一个癌前状态，如意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）和无症状骨髓瘤。随后MM 可以进展为浆细胞白血病（PCL）［2］。尽管近年来对于MM 治疗已有较大进展［3］，然而，目前的标准疗法并未改善伴有髓外病变患者的预后［4-5］。有研究［6］表明，随着MM患者生存率升高，PCL 发病率较前上升，但PCL 对于现有的治疗方案不敏感，预后较差。因此，研究与MM 疾病进展相关的机制，寻找新的预后生物标志物和治疗靶点，有助于为MM 的诊断、靶向药物研究及预后评价提供新的思路及理论依据。目前利用生物信息学工具进行数据分析已在多种肿瘤研究中得到应用，但其在MM 中的相关应用研究较少。本研究利用可公开获得的基因表达综合数据库（GEO）进行生物信息学分析，筛选MM 与PCL 的差异表达基因（DEGs），了解其生物学功能，明确关键基因与MM预后的关系。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从GEO 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中输入检索词“multiple myeloma”“extramedullary multiple myeloma”进行搜索，筛选得到含有MM 及PCL患者基因数据样本量较大的GEO基因芯片数据集GSE66291［7］以及GSE70323［8］。GSE66291 数据集平台为GPL19824，包括114 例MM患者和72 例PCL 患者基因数据样本；GSE70323 数据集平台为GPL20614，包括192 例MM 患者和62 例PCL患者基因数据样本。

1.2 MM 与PCL DEGs 的获取与分析 用R 软件（v.3.6.3）对上述两个数据集中的原始微阵列数据进行标准化及log2 转换。基于平台上的注释信息，将探针IDs 转换成相应的基因名。当多个探针对应于同一基因时，计算平均表达值来表示基因表达水平。使用R 软件读取上述两个数据集，使用LIMMA包分别在上述两个数据集中筛选DEGs，筛选标准：|log2 FC|＞1 且P＜0.05。FC（fold change）表示DEGs的差值倍数。使用R 软件中的ggplot2 和pheatmap程序包分析DEGs 的差异性表达并进行可视化，使用在线工具Draw Venn diagram（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ Venn /）绘制Venn 图，找出在两组基因芯片数据集中同时上调或者下调的交集基因，即为MM 与PCL DEGs，下简称为DEGs。

1.3 DEGs 生物学功能分析 在R 中使用Cluster-Profiler 包，采用基因本体论（GO）分析DEGs 的基因本体功能，包括生物过程、细胞组成和分子功能三个部分；采用京都基因及基因组百科全书（KEGG） 进行DEGs 的信号通路富集分析。以adjustP＜0.05 作为筛选条件选出富集结果，将其可视化。

1.4 关键基因的筛选 利用String 在线数据库（https：//string.embl.de/）对上述所得的DEGs 进行分析，构建DEGs 的蛋白质间相互作用网络（PPI），使用Cytoscape 软件（http：//cytoscape.org/）对结果进行可视化。使用Cytohubba 插件对PPI 上所有DEGs 进行评分，本研究选取相关度前20 位的DEGs作为关键基因，即hub基因。

1.5 关键基因的表达与MM 患者预后的关系分析 根据关键基因的mRNA 表达值，将MM 患者分为高表达组及低表达组，并在芯片数据集GSE24080［9-12］对高表达组及低表达组MM 患者进行生存预后分析。当P＜0.05 时，表示该基因对于MM患者总体生存率具有显著影响。

2 结果

2.1 DEGs 及其生物学功能 总共获得了210 例MM和57例PCL患者的基因数据，筛选得到DEGs共389 个，其中120 个（30.8%）基因表达上调，269 个（69.2%）基因表达下调。

GO 分析结果显示：DEGs 参与表达的细胞组分主要与细胞膜外区域相关；在生物过程方面，主要参与白细胞游走、中性粒细胞聚集、体液免疫等；分子功能方面，主要与抗原结合相关。KEGG结果提示DEGs在细胞黏附分子、局灶性黏附等相关通路上富集。

2.2 关键基因及其与MM 预后的关系 根据MCC算法选出得分前20 的基因即为关键基因，分别为LYZ，MMP8，QPCT，CRISP3，MMP9，PPBP，HBB，BPI，RNASE3，MPO，RNASE2，PLAC8，CD44，ITGA6，CDH1，CXCL12，ITGB7，ITGB3，VCAM1，PECAM1。

在GSE24080数据集中分析结果表明，CXCL12、CDH1、RNASE3、LYZ、PPBP、VCAM1、QPCT、PECAM1 的高表达组（279 例）总体生存率分别为75.6%、77.8%、74.2%、75.6%、74.6%、73.8%、76.0%、78.1%，低表达组（280 例）总体生存率分别为70.0%、67.9%、71.4%、70.0%、71.1%、71.8%、69.6%、67.5%，高表达组高于低表达组（P均＜0.05）。MMP8 基因、MMP9、CRISP3、HBB、PLAC8、ITGA6、ITGB3的下调对于MM 的总体生存率无显著影响（P均＞0.05）。

3 讨论

MM 是常见的血液系统恶性肿瘤，其髓外病变（EMD）是一种骨髓外单克隆浆细胞恶性增殖，在MM 患者诊断时的发生率为7%～17%，在疾病过程中的发生率为6%～20%［13］。PCL 是一种罕见的具有侵袭性的骨髓瘤变种，其外周血中存在20%以上的浆细胞或浆细胞绝对值大于2×109/L，占MM 患者的2%～4%［14］。尽管目前不断引入新的治疗方案［15-16］，但EMD 和PCL 仍预后不良［17-18］。因此了解从MM 到PCL 发生发展的分子机制和关键基因对于MM EMD的诊断和治疗有重要意义。

本研究选取GEO数据库中MM和PCL样本量较大的两组基因芯片数据，通过生物信息学技术对其分析，从而筛选出DEGs 共389 个，其中120 个基因表达上调，269 个基因表达下调。对于DEGs 进行GO 分析的结果提示DEGs 主要参与白细胞游走、体液免疫等生物学过程。KEGG 分析显示DEGs 在细胞黏附分子、局灶性黏附等相关通路上集中富集。这表明筛选出的DEGs 可能在干扰正常组织的免疫功能及促进肿瘤细胞侵犯正常组织方面发挥作用。对于DEGs 进行PPI分析，再通过一组基因芯片对筛选出的关键基因进行预后分析，共获得CXCL12、CDH1 等8 个关键基因，其可能在MM 进展中起重要作用。

CXCL12属于细胞趋化因子，其通过Wnt信号通路表达增强导致破骨细胞与成骨细胞的失衡，并导致克隆性浆细胞侵袭骨骼，促进MM 进展［19］。ZHANG 等［20］研究表明，CXCL12 在MM 患者骨髓中表达升高，其高表达提示预后较差。另外CXCL12参与的其他信号传导途径也与瘤细胞侵袭相关，如CXCL12/CXCR4 途径能导致胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤性疾病进展，其高表达与患者生存率呈负相关［21-22］。CDH1 属于钙黏蛋白家族，其参与细胞增殖、细胞黏附等生物学过程［23］。BI 等［24］研究表明，单克隆浆细胞会通过CDH1 途径影响浆细胞样树突样细胞，促进MM 的发病并逃避免疫监视，参与乳腺癌、胃癌等疾病相关的过程［25-26］。陈定宇等［27］研究表明，CDH1 过表达可导致胃癌患者预后较差。但目前尚未有CDH1 表达与MM 患者预后相关性的报道。PECAM1，也称为CD31，属于免疫球蛋白家族，其在促进血管生成、增加血管通透性等方面发挥作用［28-29］。PECM1 高表达可增加细胞的侵袭能力，导致肝癌、胃癌等肿瘤患者预后较差［30］。VCAM1 是一种糖蛋白，参与炎症反应、免疫疾病等过程。TERPOS 等［31］研究表明，VCAM1 水平升高的MM 患者预后较差。在胃癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中，VCAM1 高表达会促进血管生成及肿瘤转移。本研究筛选出来的其他关键基因，如RNASE3、LYZ 、PPBP 、QPCT 等在MM 与PCL 患者中虽然具有差异性表达，但与MM 相关的机制尚未明确。

本研究发现上述8 个差异基因均在MM 骨髓组织中高表达，其高表达组较低表达组总体生存率高。既往研究发现，CXCL12、CDH1、PECAM1 及VCAM1 高表达促进MM 进展，MM 患者预后较差。但本研究对其进行生存分析发现，高表达组患者生存率较高，这可能是基因检测技术的提高、新型免疫调节药物及造血干细胞移植等治疗方案广泛应用于临床，导致MM患者预后较前改善。

综上所述，MM 与PCLD 的DEGs 中120 个上调，269 个下调。DEGs 主要与细胞膜外区域相关，参与白细胞游走、与抗原结合、调控细胞黏附分子及局灶性黏附等相关通路。CXCL12、CDH1、RNASE 3、LYZ、PPBP 、VCAM1 、QPCT 和PECAM1 可能是与MM患者预后相关的关键基因，其高表达组MM患者预后较好，但本研究的结果还需要进一步进行基础实验和临床试验进行验证，这些基因可能会为MM或者其他肿瘤的研究提供新的思路。