酵母双杂交筛选与牛病毒性腹泻病毒NS4B互作的宿主蛋白

2023-03-08石金凤韩子琪刁乃超邓贺文李健明

中国兽医学报 2023年2期

丁媛，石金凤，韩子琪，刁乃超，邓贺文，李健明,3,4，时坤,3,4*，杜锐,3,4,5*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；3.梅花鹿药用资源利用关键技术研究室，吉林长春130118；4.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，吉林长春 130118；5.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)隶属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，已在全球88个国家中检测到该病原体。BVDV感染后发病机制复杂，可导致生长迟缓、生殖功能和免疫功能障碍、并发感染和持续性感染(persistent infection，PI)等，给全球养殖业造成了重大的经济损失。BVDV遗传和抗原多样性可能导致诊断和免疫失败[1]，使该病毒的防控变得复杂且具有挑战性。了解BVDV与宿主蛋白的相互作用有助于进一步探究BVDV感染和发病机理，从而开发新的治疗方法和免疫策略。

在病毒复制过程中，RNA的合成是由复制复合物(replication complex，RC)介导的。RC由病毒和宿主细胞蛋白组成，其是在内质网膜形成的囊泡中进行组装的膜结合多蛋白。NS4B是黄病毒RC的核心，在调节病毒毒力和先天免疫反应中发挥作用[2]。NS4B也是BVDV复制酶的重要组成部分，与丙型肝炎病毒(HCV) NS4B在免疫原性上具有相似的遗传特征[3-4]。众所周知，BVDV可通过逃避宿主固有免疫系统引起持续感染，研究发现BVDV NS4B可通过抑制MDA5介导的信号转导通路，发挥干扰素-β拮抗剂的作用，从而促进BVDV的增殖[5]。另一研究发现单独的NS4B可诱导自噬体，从而在BVDV复制中发挥重要功能[6]。因此，本试验以BVDV NS4B为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术，从MDBK-cDNA文库中筛选相互作用的宿主蛋白，为进一步了解NS4B蛋白功能以及探究BVDV致病机制提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料MDBK-cDNA文库、BVDV NADL株、MDBK细胞、质粒pGADT7-Rec、pGBKT7、pGADT7-T、pGADT7-Lam、pGBKT7-53、Yeastmaker Carrier DNA等由吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心保存；Y187 Yeast Strain(630457)、Y2H Gold Yeast Strain(630498)、Matchmaker Gold酵母双杂交系统(630489)、酵母双杂交培养基(630494)和c-Myc单克隆鼠源抗体(631206)购自Clontech生物公司；RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA Marker、核酸染料、常规限制性酶和EmeraldAmp®PCR Master Mix(RR300A)均购自TaKaRa公司；Seamless Assembly Cloning Kit购自中美泰和生物公司；Axygen质粒提取试剂盒购自Axygen公司。

1.2 BVDV NS4B基因的扩增根据GenBank中登录的BVDV NS4B基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物，上游引物：5′-GAATTCCCGGGG-ATCCCCTAAGAAAAAGCGCAAAGTTGCGTC-GGGTG ACGTGGAAAAAATC-3′，下游引物：5′-TAGTTATGCGGCCGCTGCAGCAGGTTCCTTATTTTCCCTTGTGAG-3′，其中下划线部分表示酶切位点，斜体部分为PKKKRKV核定位信号。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。以BVDV NADL 株cDNA为模板，PCR扩增NS4B基因序列。反应体系：PrimeSTAR Max premix 25 μL，cDNA 0.3 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 补齐至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，测序鉴定正确后保存备用。

1.3 诱饵质粒pGBKT7-NS4B的构建使用限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ分别酶切pGBKT7载体，利用Seamless Assembly Cloning Kit对纯化后的PCR产物和载体进行连接转化，提取质粒，酶切鉴定后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 诱饵蛋白NS4B表达的鉴定制备Y2H Gold酵母感受态细胞，将诱饵质粒pGBKT7-NS4B和空载体pGBKT7分别转化至酵母感受态细胞中。转化菌液经倍比稀释后涂于SD/-Trp固体培养基，30℃培养3～5 d。对阳性克隆菌落进行PCR鉴定和测序分析，提取酵母细胞总蛋白，Western blot检测BVDV NS4B蛋白的表达情况。

1.5 诱饵蛋白自激活和毒性检测将Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu(DDO)固体培养基，30℃培养3～5 d，观察菌落生长情况，判断诱饵蛋白NS4B是否具有自激活活性。将Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]和Y2H Gold[pGBKT7]菌液分别涂布于SD/-Trp固体培养基，30℃培养3～5 d，观察培养基上菌落生长情况，判断诱饵蛋白NS4B对酵母细胞是否存在毒性作用。

1.6 BVDV NS4B互作宿主蛋白筛选将4 mL酵母菌Y2H Gold-NS4B菌液和1 mL MDBK-cDNA文库接到45 mL 2×YPDA(50 mg/L Kan+)中，30℃低速培养20 h；将菌液室温1 000×g离心10 min弃上清，用10 mL 0.5×YPDA重悬菌体，涂布于QDO/X固体培养基上；同时也将Y2H Gold[pGBKT7-Lam]和Y187[pGADT7-T](阴性对照)、Y2H Gold[pGBKT7-53]和Y187[pGADT7-T](阳性对照)菌液涂布于QDO/X固体培养基上，30℃培养3～5 d；挑取蓝色单菌落进行PCR扩增、质粒抽提和测序。

1.7 BVDV NS4B互作宿主蛋白回返验证从互作蛋白中随机选择9个蛋白，分别设计引物(表1)进行PCR扩增并连接在pGADT7-Rec载体(将其简称为AD)上，然后将以上AD重组载体分别与pGBKT7-NS4B共转化到Y2H Gold酵母感受态细胞中，同时将上述重组质粒与pGBKT7共转做阴性对照组，杂交液倍数稀释后涂在SD/-Trp、SD/-Leu、DDO和QDO/X固体培养基上，30℃倒置培养3～5 d 后，观察培养基上菌落生长情况；根据QDO/X固体培养基上是否生长蓝色菌落来判定NS4B蛋白分别与AKIP1、LY6E、RABAC1、RPS20、SYNGR2、TIMM17B、LGALS1、RPL31、D18.3蛋白是否存在互作关系。

表1 引物信息

1.8 免疫共沉淀验证蛋白的相互作用构建重组质粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-RABAC1、pcDNA3.1(+)-3×Flag-SYNGR2、pcDNA3.1(+)-3×Flag-D18.3，同时构建重组质粒pcDNA3.1(+)-HA-NS4B，用BamHⅠ和XhoⅠ对上述重组质粒进行酶切鉴定，构建重组质粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-AKIP1，并用EcoRⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定和测序。分别将构建成功的重组质粒与pcDNA3.1(+)-HA-NS4B共转染至HEK293T细胞，转染48 h后用Lysis/Equilibration Buffer提取细胞总蛋白，取50 μL作为input，加入Rabbit Anti-HA抗体室温孵育20 min；Wash Buffer洗涤，加入Neutralization Buffer中和，用Elution Buffer洗脱蛋白，加入蛋白上样缓冲液煮沸5～10 min，Western blot检测蛋白互作情况。

2 结果

2.1 构建诱饵质粒pGBKT7-NS4B以BVDV NADL株cDNA为模板，PCR扩增NS4B基因片段，获得目的片段大小约为1 062 bp的片段(图1)，符合预期大小。经纯化、酶切和连接后转化至E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒经BamHⅠ和PstⅠ酶切鉴定，分别获得大小约为7 300，1 062 bp的目的片段(图1)，符合预期大小。送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序比对，构建诱饵质粒命名为pGBKT7-NS4B。

M.DL15000 DNA Marker；1～4.诱饵质粒pGBKT7-NS4B的双酶切产物

2.2 诱饵蛋白NS4B在酵母菌中的表达情况培养并收集重组酵母菌Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]，提取酵母菌体蛋白，Western blot检测诱饵蛋白NS4B的表达，结果NS4B可在酵母菌中表达，蛋白大小约为40 kDa(图2)，对照组Y2H Gold[pGBKT7]菌液未见该蛋白条带，表明诱饵蛋白NS4B可在酵母菌中正确表达。

1.对照质粒pGBKT7；2.诱饵质粒pGBKT7-NS4B

2.3 诱饵质粒pGBKT7-NS4B自激活和毒性检测Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]重组菌液在SD/-Trp固体培养基上有菌落生长(图3A)，在DDO固体培养基上无菌落生长(图3B)，表明诱饵蛋白NS4B无自激活能力。Y2H Gold[pGBKT7-NS4B](图4A)与Y2H Gold[pGBKT7]对照组菌液(图4B)在SD/-Trp培养基上的菌落生长速度及大小无明显差别，表明诱饵蛋白NS4B对酵母细胞无毒性作用，可进行后续试验。

A.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp培养基；B.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于DDO培养基

A.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp培养基；B.Y2H Gold[pGBKT7]菌液涂于SD/-Trp培养基

2.4 酵母双杂交阳性克隆的筛选结果Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]与MDBK-cDNA文库菌液杂交后，可观察到杂交液在QDO/X固体培养基上有蓝色单菌落生长，将蓝色单菌落重新转移到新的QDO/X固体培养基上进行复验，复验结果与初筛结果一致(图5)。

图5 在QDO/X培养基上筛选蓝色克隆菌落的结果

2.5 BVDV NS4B互作蛋白的筛选结果提取QDO/X固体培养基上阳性菌落的质粒，以质粒为模板，NS4B为引物进行PCR扩增，扩增产物直接进行纯化、回收、测序，测序序列经BLAST比对分析，去除相同序列的阳性克隆，初步获得14个与NS4B相互作用的候选宿主蛋白(表2)。

表2 与NS4B相互作用的蛋白筛选结果

2.6 部分互作蛋白的回复杂交试验结果对9种互作蛋白进行了酵母回复杂交试验，杂交液涂布在QDO/X固体培养基上，均出现蓝色单菌落(图6A2～I2)，表明这9种蛋白TIMM17B、LGALS1、LY6E、SYNGR2、RPL31、RABAC1、D18.3、AKIP1、RPS20均与NS4B蛋白互作。

2.7 免疫共沉淀结果将构建成功的重组质粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-RABAC1、pcDNA3.1(+)-3×Flag-SYNGR2、pcDNA3.1(+)-3×Flag-D18.3和 pcDNA3.1(+)-3×Flag-AKIP1分别与 pcDNA3.1(+)-HA-NS4B分别共转染至HEK293T细胞，转染后48 h裂解细胞，进行免疫共沉淀试验。结果表明，NS4B仅与SYNGR2(图7A)、RABACI(图7B)发生了相互作用。

3 讨论

1989年，有报道首次提出酵母双杂交技术，通过重组转录因子GAL4报告基因的激活检测蛋白质间是否存在相互作用[7]。GAL4由DNA结合结构域(DNA binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)构成[8]。该技术操作简单、体系成熟、成本较低，可有效检测二元蛋白的相互作用。此外，该方法是在胞内进行反应测定，可避免细胞裂解对反应的影响，该技术已广泛用于蛋白互作研究。ZHANG等[9]利用酵母双杂交技术检测出经典猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)NS4B与猪RING指蛋白114(pRNF114)C端结构域存在相互作用，并指出该相互作用可抑制CSFV复制，从而阐明了pRNF114对CSFV的抗病毒机制。QIAN等[10]也使用该技术筛选出CSFV NS4B的互作蛋白FHC，并指出NS4B可能通过与FHC互作影响病毒的复制过程。吴涛等[11]以猪链球菌2型(SS2)透明质酸酶(HYL)作为诱饵蛋白,利用CytoTrap酵母双杂交系统,从人的肺脏组织cDNA文库中筛选与HYL相互作用的蛋白,探索出HYL在SS2致病中的作用。郑博伟等[12]利用酵母双杂交技术筛选出与E种肠道病毒HY12毒株编码VPI蛋白的宿主互作蛋白，为研究牛肠道病毒感染机制及病毒结构蛋白VPI的功能奠定了基础。关于BVDV NS4B互作蛋白的研究较少，因此，本试验将BVDV NS4B蛋白融合到BD载体上，构建了重组质粒pGBKT7-NS4B，与实验室前期制备的MDBK-cDNA文库，进行了酵母双杂交试验。

在试验前期需要确定诱饵蛋白NS4B是否具有自激活活性和对酵母细胞是否有毒性作用。若诱饵蛋白具有自激活活性，则无需与宿主蛋白结合便可直接激活UAS下游基因进行转录，造成假阳性结果。杂交试验是在胞内进行的，若诱饵蛋白对酵母细胞具有毒性作用，则会出现假阴性结果。因此，将诱饵质粒pGBKT7-NS4B转化到Y2H Gold酵母感受态细胞中，转化液分别涂于SD/-Trp、DDO固体培养基上来验证诱饵蛋白NS4B无自激活活性。利用酵母Y2H Gold菌株在氨基酸(Trp、His、Leu或Ade)缺失培养基上无法生长，但BD和AD载体上带有Trp、Leu转化标记，可分别在SD/-Trp、SD/-Leu培养基上生长的特性，将Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]与Y2H Gold[pGBKT7]菌液涂于氨基酸缺失培养基上来验证诱饵蛋白NS4B对酵母细胞无毒性作用。

A1.BD+AD-TIMM17B；A2.BD-NS4B+AD-TIMM17B；B1.BD+AD-LGALS1；B2.BD-NS4B+AD-LGALS1；C1.BD+AD-LY6E； C2.BD-NS4B+AD-LY6E；D1.BD+AD-SYNGR2；D2.BD-NS4B+AD-SYNGR2；E1.BD+AD-RPL31；E2.BD-NS4B+AD-RPL31；F1.BD+AD-RABAC1；F2.BD-NS4B+AD-RABAC1；G1.BD+AD-D18.3；G2.BD-NS4B+AD-D18.3；H1.BD+AD-AKIP1；H2.BD-NS4B+AD-AKIP1；I1.BD+AD-RPS20；I2.BD-NS4B+AD-RPS20

采用Y2H系统初步筛选出14种与BVDV NS4B互作的宿主蛋白，均对细胞具有调控作用，参与调节宿主能量代谢、细胞增殖和凋亡等过程，或与病毒感染、复制和免疫逃逸有关。研究表明，GAPDH[13-14]、LY6E[15-17]、RABACI[18-19]、SYNGR2[20-21]、LGALS1[22-24]、RPL31[25]和RPS20[26]蛋白均可与某些病毒蛋白发生相互作用，从而参与病毒的感染和复制过程。AKIP1[27]、TIMM17B[28]、ENTPD6、FAM96B、FLNA[29- 30]、IL-17RA[31-32]、D18.3蛋白参与了细胞凋亡、细胞增殖与分化、免疫反应和遗传疾病等过程，但在病毒学中的功能仍不明确。通过免疫共沉淀进一步明确NS4B与SYNGR2、RABACI发生了相互作用。先前的研究表明，SYNGR2基因突变会影响猪圆环病毒2型(PCV2)病毒的复制能力，SYNGR2被特异性siRNA沉默时，PK15细胞中的PCV2滴度会出现降低[32]。此外，SYNGR2还可能在受监管的外泌体中发挥作用，调节囊泡的形成和成熟。RABACI也是一种高尔基复合体囊泡形成所需的蛋白调节剂，控制囊泡间对接和融合。RABACI可与酵母双杂交系统中的多种异戊二烯化Rabs相互作用，有研究表明，可以通过抑制异戊烯化作用来减弱HCV的复制[32]。