兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

王锦祥，林松华，陈冬金，孙世坤，陈岩锋，桑 雷，谢喜平

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

兔葡萄球菌病是兔的常发病和多发病，是危害兔产业发展的重要疫病之一。该病的病原是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，临床上常见乳房炎、脚皮炎以及组织和器官的脓肿，也可见呼吸道症状[1-2]。

兔产业是福建省畜牧业的重要组成部分。福建统计年鉴显示，2020年年末福建省家兔存栏量和出栏量分别为565.15万只和1 125.86万只，均居全国前列。兔葡萄球菌病在福建省兔群中广泛流行。根据分离鉴定的兔源金黄色葡萄球菌的毒力差异，可将这些分离菌划分为强毒力、低毒力菌株[3-5]。强毒力菌株包括序列型为ST121和ST3320的分离菌，能在兔群中快速传播，引起所有日龄兔的致死性呼吸道感染，在短期内能导致大量感染兔的死亡，造成严重的经济损失[3,5]。低毒力菌株则是序列型为ST398的分离菌，在兔群中呈点状慢速扩散，引起慢性化脓性感染，如乳房炎、脚皮炎以及组织和器官脓肿等，感染兔病程长，最终以机体极度消瘦而死亡[4]。由此可见，与低毒力菌株相比，强毒力金黄色葡萄球菌对兔产业的危害更为严重。因此，建立一种快速、特异性强且敏感性高的检测方法以及时、准确地掌握兔源强毒力金黄色葡萄球菌在兔群中的流行情况，对保障兔产业的发展具有重要意义。

目前，用于兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法有细菌分离鉴定[3-5]、双重PCR方法[6]和环介导等温扩增方法[7]，尚未见荧光定量PCR方法的报道。本试验根据兔源强毒力金黄色葡萄球菌为pvl基因阳性而低毒力菌株为pvl基因阴性的特点[3-5]，针对pvl基因设计特异性的引物和探针，建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法，进一步丰富兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法。

1 材料与方法

1.1 菌株供试菌株包括兔源强毒力和低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、魏氏梭菌(Clostridieumwelchii,C.welchii)和大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)均由本实验室分离保存，所有供试菌株均用脑心浸出液培养基培养。

1.2 主要试剂和仪器细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、2×Probe qPCR SuperMix和pEASY-T1载体购自北京全式金生物技术股份有限公司；Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪购自Eppendorf公司。

1.3 引物和探针的设计根据本实验室分离鉴定的兔源强毒力金黄色葡萄球菌的pvl基因序列，以及该基因在NCBI数据库中的BLAST分析结果，应用Oligo软件设计了针对该基因保守序列的引物和探针。引物序列为pvl-F:5′-atacaaagccaaatccaaa-3′/pvl-R:5′-gtgcataatctacaacgttt-3′，探针序列为pvl-P:5′-atgttgtacttagaaccccaa-3′，探针的5′端和3′端分别标记荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。目的基因的预期扩增长度为114 bp。引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。

1.4 荧光定量PCR方法的初步建立及扩增产物的鉴定以兔源强毒力金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应体系：2×Probe qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探针(10 μmol/L)0.4 μL，基因组DNA 1 μL，灭菌双蒸水7.8 μL，共20 μL。反应程序：94℃ 5 min，40个循环(94℃ 5 s，60℃ 30 s)，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离回收并测序，测序结果与参考基因进行BLAST比对分析，确定引物和探针的特异性。

1.5 荧光定量PCR检测方法反应条件的优化在探针终浓度为0.2 μmol/L、退火延伸温度为60℃条件下，将引物终浓度设置为0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 μmol/L进行荧光定量PCR扩增，确定最佳引物浓度；在最佳引物浓度和退火延伸温度为60℃条件下，将探针终浓度设置为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L 进行荧光定量PCR扩增，确定最佳探针浓度。在最佳引物和探针浓度条件下，将退火延伸温度设置为55.1～65.8℃进行梯度扩增，确定最佳退火延伸温度。

1.6 荧光定量PCR检测方法的特异性以兔源强毒力和低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大肠杆菌的基因组DNA为模板，应用建立的荧光定量PCR方法进行检测，以灭菌ddH2O为阴性对照，评估该方法的特异性。

1.7 荧光定量PCR检测方法的敏感性和标准曲线的建立以兔源强毒力金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，应用本试验设计的pvl基因上、下游引物进行普通PCR扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收，克隆到pEASY-T1，转化DH5α感受态细胞，得到重组质粒pEASY-T1-pvl。根据重组质粒pEASY-T1-pvl的浓度，计算其拷贝数，以该重组质粒为模板，并将其在反应体系中的终浓度设置为1×108～1×100拷贝/μL，应用建立的荧光定量PCR方法进行检测，以灭菌ddH2O为阴性对照，评估该方法的敏感性并绘制标准曲线。

1.8 荧光定量PCR检测方法的重复性将pEASY-T1-pvl重组质粒在反应体系中的终浓度设置为1×108～1×106拷贝/μL，应用建立的荧光定量PCR方法进行同一批次和不同批次的检测，每次检测时每份样品重复3次，计算批内和批间的变异系数(CV)，评估该方法的重复性。

1.9 荧光定量PCR检测方法的初步应用选取从福建省不同地区采集的126份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品，其中包括强毒力金黄色葡萄球菌阳性样品13份(ST121型菌株和ST3320型菌株阳性样品分别为6，7份)、低毒力金黄色葡萄球菌样品27份、多杀性巴氏杆菌阳性样品43份(A型、D型和F型多杀性巴氏杆菌阳性样品分别为15，15，13份)、支气管败血波氏杆菌阳性样品15份、肺炎克雷伯菌阳性样品14份和大肠杆菌阳性样品14份。分别提取这些样品的基因组DNA，应用本试验建立的荧光定量PCR方法和已报道的双重PCR方法[6]及环介导等温扩增方法[7]同时进行检测，对比该方法与已知结果、双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果，评估该荧光定量PCR方法的临床实用性。

2 结果

2.1 荧光定量PCR方法的初步建立及扩增产物的鉴定结果显示，该方法对兔源强毒力金黄色葡萄球菌的基因组DNA有明显的扩增曲线，对阴性对照(灭菌ddH2O)则无扩增曲线(图1A)。将荧光定量PCR的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示，该方法从兔源强毒力金黄色葡萄球菌的基因组DNA中扩增到长度为114 bp的条带(图1B)，与预期的目的条带相符。将该片段回收后测序，测序结果表明该片段的序列与参考基因的序列完全一致。

M.DL5000 DNA Marker;1.兔源强毒力金黄色葡萄球菌;2.阴性对照

2.2 荧光定量PCR检测方法反应条件的优化在探针终浓度为0.2 μmol/L和退火延伸温度为60℃条件下，当引物的终浓度为0.6 μmol/L时，荧光定量PCR的扩增效果最优(图2)。在引物浓度为0.6 μmol/L和退火延伸温度为60℃条件下，当探针的终浓度为0.3 μmol/L时，荧光定量PCR的扩增效果最优(图3)。在引物和探针浓度分别为0.6，0.3 μmol/L 条件下，当退火延伸温度为59.8℃时，荧光定量PCR的扩增效果最优(图4)。因此，确定该荧光定量PCR方法的最佳反应条件为引物和探针终浓度分别为0.6，0.3 μmol/L，退火延伸温度为59.8℃。

图2 荧光定量PCR方法引物浓度的优化

图3 荧光定量PCR方法探针浓度的优化

图4 荧光定量PCR方法退火延伸温度的优化

2.3 荧光定量PCR检测方法的特异性结果显示，该方法仅对兔源强毒力金黄色葡萄球菌的基因组DNA有扩增曲线，对其他兔源病原菌，包括兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大肠杆菌的基因组DNA和阴性对照均无扩增曲线(图5)，表明该方法特异性良好。

1.兔源强毒力金黄色葡萄球菌;2～8.兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照

2.4 荧光定量PCR检测方法的敏感性和标准曲线的建立结果显示，该方法的最低检测限为10 拷贝/μL(图6)。该方法的标准曲线方程为y=-3.259x+43.81，CV为0.995，扩增效率为103%(图7)，表明该方法反应体系中模板浓度(x轴)与Ct值(y轴)之间具有良好的线性关系，且扩增效率较高。

1～9.1×108～1×100 拷贝/μL的pEASY-T1-pvl重组质粒模板;10.阴性对照

图7 荧光定量PCR方法的标准曲线

2.5 荧光定量PCR检测方法的重复性结果显示，批内和批间重复性试验的CV均小于2%(表1)，表明该方法重复性好。

表1 荧光定量PCR方法的重复性试验

2.6 荧光定量PCR检测方法的初步应用结果显示，荧光定量PCR方法检测到兔源强毒力金黄色葡萄球菌阳性样品13份，阴性样品113份，该结果与已知结果、双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致，表明该荧光定量PCR方法准确性好，具有很好的临床实用性。

3 讨论

兔葡萄球菌病广泛流行于世界各地的兔群中，是危害兔产业发展的重要疫病之一[8]。前期有研究表明，该病的病原金黄色葡萄球菌包含两种毒力差异较大的菌株，强毒力菌株引起急性的致死性呼吸道感染，而低毒力菌株则引起组织器官的慢性化脓性感染[3-5]。由此可见，强毒力菌株的流行能造成兔产业的严重经济损失，实现对该菌快速且准确地检测，对保障兔产业的发展具有重要意义。

荧光定量PCR是重要的病原快速检测方法之一，已被广泛应用于各种病原菌的快速检测，如大肠杆菌、沙门菌和多杀性巴氏杆菌等[9-10]。本试验以兔源强毒力金黄色葡萄球菌的pvl基因(低毒力菌株为pvl基因阴性)为目的基因，建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法。pvl基因编码的杀白细胞毒素经受体介导能在白细胞的细胞膜上形成穿孔而导致白细胞凋亡[11]，由于携带该基因的金黄色葡萄球菌都具有很强的致病性，因此该基因也成为强毒力金黄色葡萄球菌的重要标记[12-14]。由此可见，本试验以pvl基因为靶基因建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法是可行的。

本试验建立的荧光定量PCR方法特异性强，仅对兔源强毒力金黄色葡萄球菌的基因组DNA有扩增，而对常见的兔源病原菌(兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大肠杆菌)的基因组DNA的扩增结果均为阴性。本试验建立的荧光定量PCR方法速度快，仅需约50 min就能完成检测，比已报道的用于检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的双重PCR方法[6](约需1.5 h)和环介导等温扩增方法[7](约需1 h)的耗时都短，能有效地提高检测效率。此外，本试验建立的荧光定量PCR方法的最低检测限可达到1×101拷贝/μL，比已报道的双重PCR方法[6-7](最低检测限为1×104拷贝/μL)和环介导等温扩增方法[7](最低检测限为1×102拷贝/μL)的最低检测限分别高1 000倍和10倍，适用于病原菌含量低的样品检测。由此可见，本试验建立的荧光定量PCR方法不仅丰富了现有的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法，也为兔源强毒力金黄色葡萄球菌的快速检测提供了技术支持。