阿司匹林丁香酚酯对LPS诱导的Caco-2细胞炎症的作用效果对比

陶 琦，刘希望，秦 哲，李世宏，白莉霞，杨亚军，李剑勇

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

肠炎的发病率很高，严重危害养殖业发展与人类健康。目前，对肠炎的治疗方法主要依靠抗生素，但这些药物常常造成肠道菌群失调、抗生素残留、环境污染等问题，且效果并不理想[1-2]。Caco-2细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)是一种人结肠腺癌细胞，最早由美国堪萨斯大学药学院Ronald T.Borchardt 实验室，以及英国的Ciba-Geigy实验室在20世纪80年代后期建立的，是第一个被国外制药企业以及实验室广泛应用的肠道吸收细胞模型[3-4]。2002年被国际认定为动物实验替代方法，已经被FDA批准[5]。

肠炎是指肠壁表层和深层组织的炎症，由于致病因素的刺激导致肠道发生不同程度的水肿、充血、出血、溃疡、化脓、坏死等病变，临床以消化紊乱、腹痛、腹泻以及发热为特征[6]。肠炎一般分为2种：感染性肠炎和非感染性肠炎。感染性肠炎常由病原微生物或其他因素诱发，常见的病原主要有细菌(致病性大肠杆菌、魏氏梭菌、痢疾杆菌等)、病毒(犬瘟热病毒、犬细小病毒、轮状病毒等)、寄生虫(鞭毛虫、球虫、弓形虫等)、真菌(藻状菌、曲霉菌、白念珠菌等)，其中以大肠杆菌导致的细菌性肠炎最为普遍[7]；非感染性肠炎多与环境、营养、免疫等应激因素有关[6]。而炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因未明的慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)，其发病机制尚不十分清楚，因此临床上治疗和预防肠炎仍是待解决的难题[8]。肠道也是机体免疫的重要器官[9]，肠道免疫在人类炎性肠病、肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、过敏性疾病及结肠癌中起着关键性作用[10-12]。在机体正常条件下，细胞分泌的细胞因子参与机体固有和适应性免疫应答调节，促进损伤组织的修复，参与细胞间的调控[13]。然而当机体被微生物入侵时，多种细胞因子在短期内快速分泌，超出机体免疫调节范围，造成局部炎症反应，损伤机体组织和器官[14]。促炎细胞因子是炎症反应早期产物，已证实，IBD患者的肠道中分泌大量促炎细胞因子[15]，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17 和IFN-γ。

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)是利用结构拼合的前药原理，以丁香酚(eugenol,EUG)对阿司匹林(aspirin,ASP)进行酯化修饰而合成的一种新型药用化合物，其降低了阿司匹林对胃肠道的刺激性，同时增强了挥发油丁香酚的稳定性。研究表明，AEE具有确切的抗炎、抗氧化、降血脂、预防动脉粥样硬化和预防血栓形成和抗急性肝损伤等作用[16-18]，效果优于前体药物ASP和EUG，具有很好的成药性。基于以上研究成果，推测AEE可能对IBD有一定的作用效果。鉴于此，本试验以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导Caco-2形成细胞炎症模型，并采用响应面法优化该炎症模型，通过对促炎细胞因子产生的影响，探讨AEE对该炎症模型的治疗、预防和保护作用，以及与其前体药物药效的差异，为AEE在肠炎防治方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人结肠腺癌细胞Caco-2购自中国科学院上海细胞库；MEM培养基、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、胰酶购自Gibco公司；LPS(Sigma-Aldrich，批号L4391)；阿司匹林丁香酚酯(含量99.8%，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所自制)；阿司匹林(含量99.8%，中国食品药品检定研究院)；丁香酚(含量99.95%，北京中科质检生物技术有限公司)；CCK-8(Sigma-Aldrich，批号96992)；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA检测试剂盒购自上海酶联；酶标仪(Thermo Multiskan GO)。

1.2 药物配制将AEE溶解在DMSO中，配制成浓度为256 mmol/L的溶液作为母液，每种浓度用DMSO倍比稀释后备用。将不同样品中DMSO的最终浓度控制在0.5%以下；ASP及EUG操作同上；LPS用PBS溶解，配制成10 g/L的母液备用。

1.3 Caco-2细胞培养Caco-2细胞培养于MEM培养液(含20% FBS，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺，1%丙酮酸钠)中，接种于T-25 cm2细胞培养瓶(Corning®)中，置于37℃、5% CO2、90%相对湿度的细胞培养箱中进行培养，隔日换液。在倒置显微镜下观察，当瓶中细胞生长达到90%左右时，用PBS洗涤除去非贴壁细胞，然后加入0.8 mL胰酶消化液进行消化传代，进行以下试验。

1.4 Caco-2细胞毒性试验取对数生长期Caco-2细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，于96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h，弃掉培养液。试验组：各孔加入100 μL不同质量浓度的LPS溶液(0.3，0.75，1.5，3，6，12，25，50，100 mg/L)，每个质量浓度设置6个平行的重复孔；正常组：加入100 μL 不含LPS的细胞培养基，设置6个平行的重复孔；空白组：不含细胞的孔中，加入细胞培养液，设置6个平行的重复孔。将细胞分别培养24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养1～2 h后，用酶标仪测量D450 nm值。相同方法检测AEE、ASP、EUG、ASP+EUG(1∶1)对Caco-2细胞的毒性。计算细胞活力公式如下：细胞活力=(试验组-空白组)/(正常组-空白组)×100%。

1.5 基于响应面优化LPS诱导Caco-2细胞炎症的作用浓度和时间以IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量为指标，采用响应面分析法中的User-Design，优化LPS的质量浓度和作用时间。将浓度和作用时间的参数范围输入Design-Expert 软件，生成User-Design响应面试验表，即LPS对Caco-2细胞的作用浓度和时间(表1)，依此安排试验。加入LPS后，于对应时间点从6孔板中取300 μL细胞上清液，再补充300 μL的新鲜培养液，继续培养至相应时间点以移取上清液。根据试剂盒说明书处理上清液样品，检测IL-1β、IL-6和TNF-α的生成量；将结果带入软件分析，得出LPS诱导Caco-2细胞炎症模型的最佳时间和最佳浓度。

1.6 AEE对LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型作用方式将Caco-2细胞分为空白组和试验组，空白组不经任何处理，正常培养；试验组进行以下处理。同时检测不同处理组IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.6.1AEE预防作用 用不同浓度的AEE(4，16，32 μmol/L)孵育24 h后，弃上清，加入最佳浓度的LPS孵育至最佳时间后取样检测。

1.6.2AEE保护作用 将前述不同浓度的AEE与最佳浓度的LPS混合，孵育至最佳时间后取样检测。

1.6.3AEE治疗作用 以最佳浓度的LPS孵育至最佳时间后，弃上清，加入前述不同浓度的AEE孵育24 h后取样检测。

1.7 AEE与其前体药作用效果对比根据1.6的结果得出AEE的最佳作用浓度，然后配制相同浓度的ASP、EUG、ASP+EUG(1∶1)溶液，以相同方法进行相关试验，对比作用效果。

2 结果

2.1 药物对Caco-2细胞活性的影响CCK-8法检测LPS对Caco-2细胞活力的影响(图1),AEE、ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)对Caco-2细胞活力的影响(图2)。结果显示，LPS质量浓度在0.3～25 mg/L时，细胞活力随着质量浓度的增加而增加，说明在此质量浓度范围内LPS对Caco-2细胞活力有促进作用。随着质量浓度的继续增加，细胞活力又有一定的下降，但细胞活力仍在95%以上。在所选的浓度范围内，AEE和ASP对Caco-2细胞活力的影响较小，无显著性差异。但256 μmol/L 的EUG及ASP+EUG(1∶1)，对Caco-2细胞活力有显著影响(P<0.001)；故其浓度选定在0～128 μmol/L。

与空白对照组相比***P<0.001

2.2 基于响应面优化LPS诱导Caco-2细胞炎症的作用浓度和时间

2.2.1试验方案及结果 如表1所示。

表1 User-Design试验设计及其结果

2.2.2响应面模型的拟合 基于表1所示的模拟响应结果，建立IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量与时间和浓度之间的回归模型：IL-1β=18.897 1- 0.028 8A+0.044 7B-2.506 6E-004AB+2.751 2E-004A2+0.010 3B2;TNF-α=8.495 1+0.027 7A+0.274 8B-3.224 2E-004AB-2.484 7E-004A2;IL-6=9.943 1-0.019 7A-0.124 5B+3.790 2E-004AB+2.999 2E-004A2+8.426 9E-003B2。

对IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量与时间和浓度之间的回归方程进行方差分析(表2)，结果显示，3个指标回归模型的P值均小于0.05，说明该模型显著，可进行分析和预测。

A.AEE；B.ASP；C.EUG；D.ASP+EUG(1∶1)。与空白对照组相比***P<0.001，*P<0.05

2.2.3响应曲面分析 为了更加直观地表示各因素与响应目标之间的关系，利用三维曲面图进一步分析各因素对IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量的影响。由Design-Expert 8.0.5软件对回归模型进行优化分析得到IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量的最佳条件是LPS质量浓度为100 mg/L，LPS作用时间为24 h，在此条件下，预测IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量能达到最大(图3)。

表2 回归方程的方差分析

2.3 LPS及受试药物的细胞毒性作用CCK-8试验结果显示，LPS在所选的浓度范围内对Caco-2细胞活力无影响，甚至低浓度的LPS对其还有一定的促进作用。响应面分析的结果显示，LPS最佳质量浓度为100 mg/L，作用最佳时间为24 h。与正常组比较，LPS组IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度显著升高，表明Caco-2细胞炎症模型诱导成功。

A.IL-1β;B.TNF-α;C.IL-6

受试药物的细胞毒性试验结果显示，EUG和ASP+EUG(1∶1)的浓度为256 μmol/L时，可致细胞活力显著下降(P<0.05)，可能与丁香酚的性质有关[19-20]；而AEE和ASP的浓度为256 μmol/L时，对Caco-2的细胞活力无显著影响(P>0.05)，且AEE浓度为32 μmol/L时，对Caco-2细胞活力有促进作用(P<0.05)。因此，本研究中受试药物浓度为4，16，32 μmol/L。

2.4 AEE对LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型的作用不同浓度AEE的作用结果如图4所示。在各作用方式下，高浓度AEE组的细胞因子水平均低于低、中浓度组(P<0.05)，且呈现一定的浓度依赖性。在该细胞模型上，AEE治疗后IL-6水平显著低于AEE预防和保护后的水平(P<0.05)(图4A)，而细胞因子IL-1β则与AEE预防和保护后的水平无显著性差异(P>0.05)(图4B)；AEE治疗后的TNF-α水平显著低于AEE保护后的水平(P<0.05)，而与AEE预防后的TNF-α水平无显著性差异(P>0.05)(图4C)。以上结果说明，AEE对LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型治疗效果较好。

A.IL-6；B.IL-1β；C.TNF-α。与空白对照组相比**P<0.01，*P<0.05；与LPS组相比###P<0.001，##P<0.01

2.5 AEE与其前体药作用效果的对比在治疗作用的条件下，AEE及前体药物的浓度均为32 μmol/L，各细胞因子的生成量见图5。结果显示，AEE治疗后，细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的量均低于ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)(P<0.05)，表明AEE的治疗效果优于其前体药物。

与空白对照组相比***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05；与LPS组相比###P<0.001，##P<0.01

3 讨论

炎症是机体的正常防御活动，是先天免疫系统针对组织损伤、感染或刺激做出的复杂生物反应[21]。然而，过度和不受控制的炎症反应可能会对身体造成损害。肠上皮细胞(IEC)被认为是肠黏膜屏障的重要组成部分，IEC的物理屏障在肠道炎症期间起着重要作用，可有效防止病原体进入，并通过分泌多种炎症介质积极参与先天性和获得性免疫反应[22-23]。

多项研究证明，Caco-2细胞适用于肠道炎症的相关研究，通过相关细胞因子或LPS诱导Caco-2细胞的炎症模型是最常用的体外肠道炎症模型[24-25]。促炎细胞因子在调节肠道免疫中起到重要作用，其中，IL-1β、TNF-α和IL-6异常被视为IBD的重要发病机制。IL-1β是炎症反应的重要因子，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。TNF-α是由157个氨基酸组成的肽类促炎因子，相对分子质量为17 kDa[26]，主要作用是诱导细胞凋亡。IL-6是由184个氨基酸组成，相对分子质量为26 kDa的糖蛋白[27]，是一种重要的促炎细胞因子，其表达主要受到IL-1β和TNF-α的诱导。因此，本试验采用LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型来模拟肠炎的发生，通过对IL-1β、TNF-α和IL-6产生的影响，反映Caco-2细胞炎症模型造模是否成功。通常IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量显著上升，说明造模成功[28- 29]。

响应面法是优化造模条件的常用方法，其使用特定点的函数值，用多项式表达来逼近极限状态函数，与正交试验相比，更加接近最优值[30]。因此，本试验采用响应面法优化LPS诱导Caco-2细胞炎症模型的作用浓度与时间。据此确定的最佳条件为LPS质量浓度100 mg/L、作用时间24 h，此结果与吴喜喜等[24]结果一致。当LPS质量浓度为100 mg/L，作用Caco-2细胞24 h后，LPS组的IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著高于空白对照组(P<0.001)。结果显示，Caco-2细胞炎症模型诱导成功。

大鼠体内试验结果已表明，AEE可以显著降低与炎症形成相关的5种关键内源性生物活性酶(环氧合酶-1、环氧合酶-2、C-反应蛋白、凝血酶原和花生四烯酸 5-脂肪氧化酶)的活性[31]。然而，AEE对损伤条件下IEC炎症反应的影响尚不清楚。因此，本试验首次通过LPS诱导Caco-2细胞形成炎症模型来探讨AEE防治肠炎的效果。结果发现，AEE治疗Caco-2细胞炎症模型后，IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平均显著地下降(P<0.05)，这类似于多种中药单体抗炎作用，例如，槲皮素[32]、木犀草素[33]和枸杞多糖[34]。AEE治疗Caco-2细胞炎症模型后IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量显著低于前体药物ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)的治疗(P<0.05)，说明AEE治疗Caco-2细胞炎症模型的效果优于前体药物ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)，这可能与EUG对ASP进行酯化修饰后二者发挥协同作用或产生了新的作用机制有关。

研究表明，NF-κB信号通路激活IEC产生促炎细胞因子[35]。NF-κB是一种在炎症、细胞分化和恶性肿瘤细胞的增殖和存活中具有关键作用的转录因子，参与细胞外来刺激的反应[36-37]。在正常状态下，NF-κB通常通过与IκB蛋白结合在细胞质中没有活性。但当受到外源性刺激物(例如IL-1β、TNF-α、LPS和细菌等)刺激时，NF-κB被激活并与IκB分离。然后NF-κB被转移到细胞核中，调节许多与炎症相关基因的表达[38]，包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12。大量研究表明，NF-κB通路在IBD的发病机制和进展中起着关键作用[39-40]。TNF-α、IL-1β和IL-6分泌异常被视为IBD的重要发病机制，抑制这些促炎细胞因子产生是评估抗炎药疗效的关键因素[41]。AEE可显著地降低Caco-2细胞炎症模型中的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量，说明AEE可能也是通过抑制NF-κB通路达到治疗肠炎的效果。

综上所述，AEE作用于Caco-2细胞炎症模型时，呈现一定的浓度依赖性。AEE可显著减少IL-1β、TNF-α和IL-6细胞因子的表达与分泌，缓解炎症反应，且AEE的治疗效果要显著优于其前体化合物；AEE对Caco-2细胞炎症模型的治疗作用优于预防和保护作用，具体抗炎机制有待进一步研究。