全自动蒸馏-流动分析仪联用测定木薯粉中氰化物

王绿波，刘金凤，王昊，房彦军，孙景然，赵慷，赵友全*

（1.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.天津市生物医学工程与检测技术重点实验室，天津 300072；3.军事医学研究院作业医学与环境医学研究所，天津 300054；4.北京海光仪器有限公司，北京 100193）

氰化物的毒性来源于氰苷的水解。氰苷在自然界中广泛存在于众多高等植物的根、茎、叶中[1-3]，氰苷自身无毒，只有植物自身受到破坏时，会生成醇腈，并在酶的作用下裂解，产生毒性[4]。接触氰化物存在严重的健康风险[5]，不仅会影响人体发育，严重者会导致神经病变、精神错乱和急性死亡[6]。木薯作为目前世界上第六大最重要的粮食作物[7]，有“淀粉之王”之称，淀粉含量高于玉米和马铃薯，且价格更低，所以从生产成本出发，木薯具有更高的经济和效用价值[8]。木薯可以加工成不同的产品，如薯片、西米、木薯面包等[9]。木薯淀粉以其产量高、价格低的优势还可作为乙醇的生产来源[10]，可用作工业酒精和食用酒精的原料。但是当木薯通过发酵和蒸馏生产蒸馏酒时，会释放出有毒的氰化物[11]危害人体健康。木薯中的氰化物普遍存在于木薯叶、茎以及根中[12-13]，而且木薯中的氰化物含量很高[14-15]，如果食用的木薯产品加工不良，氰化物脱毒不完全，最终会导致急性氰化物中毒[16]。研究表明可食用木薯粉中氰化物的含量应低于10 mg/kg[17]，所以对木薯中氰化物的检测具有非常重要的意义。

目前，食品中测定氰化物含量的方法，主要依赖于GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中的分光光度法、气相色谱法以及定性法[18]，除此之外，还有原子吸收分光光度法[19]、双波长叠加（异烟酸-硫代巴比妥酸）分光光度法[20]、滴定法[21]、化学传感器技术[22]、连续流动注射法[23]等技术和方法，其中分光光度法是目前检测机构主要的测定方法[24]。Virbickas等[25]提出采用安培法、循环伏安法和快速傅里叶变换电化学阻抗谱法来测定水中氰化物浓度，但是这些集成电路的电流输出有限，所以测量精度不高。La等[26]采用荧光探针的方法对氰化物的含量进行检测，但是目前的研究表明，荧光探针在氰化物含量测定中存在较多问题，比如没有生物靶向性、溶解性差、受外界环境温度、pH值影响大等，这些问题也导致荧光探针的技术在氰化物含量测定中不能得到广泛普及[27]。GB5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中的分光光度法[28]的蒸馏过程采用传统蒸馏仪，安装过程繁琐、耗时长、加热不安全，需要肉眼观察蒸馏液是否到达滴定终点。色谱法成本较高、操作繁琐，而且受硫氰酸盐的影响。滴定法和连续流动注射法只适用于地表水、生活用水以及污水的检测，很难对食品中的氰化物进行检测。黄一帆等[29]用连续流动注射分析测定木薯粉中的氰化物时，采用滤纸过滤的方式进行分离的前处理，得到氰化物提取液，这会使氰化物的提取不完全，在提取过程中造成氰化物损失，准确度降低。

本文提出一种全自动、高效的方法对木薯粉中氰化物含量进行检测，将自主研发的全自动快速水蒸气蒸馏仪与氰化物连续流动分析仪联用，实现对木薯粉中的氰化物进行提取和检测，解决现有流动分析仪无法直接对固体食品氰化物含量进行检测的问题，并进一步实现大批量检测。本文将提出的方法与GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中的分光光度法进行对照，来检测测量结果的准确性。本文提出的方法能够缩短检测时间、节省人力物力、提高检测效率，以期为食品中氰化物的含量检测提供一种新方法，为食品检测提供更加方便、快捷的方法参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

全自动水蒸气蒸馏仪：天津大学自主研发；分光光度计（UV-2450型）：日本岛津公司；氰化物连续分析仪（HGCF系列）、进样器（ASX-280）：北京海光仪器有限公司；搅拌器（SN-JJ）：上海尚仪有限公司。

1.2 材料与试剂

木薯粉：河南（地区 1）、泰国（地区 2）、江苏（地区3）。乙酸锌、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钾、1，3-二甲基巴比妥酸、乙醇、酚酞、酒石酸、吡唑啉酮、乙酸、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；异烟酸（分析纯）：天津市津科精细化工研究所；氯胺T（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；50.0 μg/mL水中氰成分分析标准物质GBW（E）080115：中国计量科学研究院。

1.0 μg/mL氰化物标准中间液：吸取2 mL水中氰成分分析标准物质，用0.01 mol/L氢氧化钠溶液定容至100 mL。

工作缓冲溶液：称取9.2 g氢氧化钠、82 g邻苯二甲酸氢钾溶解于800 mL水中，用水定容至1 L，混匀，调节pH值为5.2±0.1，混匀。

异烟酸-巴比妥酸溶液：称取4.4 g氢氧化钾、8.4 g异烟酸、6.8 g 1，3-二甲基巴比妥酸溶解于300 mL水中，60℃水浴加热10 min，直至溶解，冷却至室温25℃后用水定容至500 mL，混匀。调节pH值为5.2±0.1。

2 g/L氯胺T溶液：称取1 g氯胺T溶于水中，并稀释至500 mL，现用现配。

本文的对照组为异烟酸-吡唑啉酮分光光度法，试剂配制按GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》第一法中的要求进行。

1.3 氰化物连续流动分析仪及进样器工作条件

保温温度37℃、取样时间90 s、清洗时间140 s、空气流量100 mL/min、下放深度150 mm。

1.4 方法

1.4.1 氰化物含量检测蒸馏过程

称取木薯粉样品5 g，加入50 mL的2 g/L NaOH溶液，搅匀。然后转移到蒸馏反应瓶中，向蒸馏反应瓶中加入2 g酒石酸和5 mL的100 g/L乙酸锌溶液，启动全自动水蒸气蒸馏仪，吸取10 mL的2 g/L氢氧化钠溶液放置于烧杯中，用于接收蒸馏液。选择称量模式，设置40 mL为蒸馏终点，并启动开始蒸馏按钮。到达蒸馏终点，仪器将自动关停，将蒸馏液转移至50 mL具塞比色管中，并用0.01 mol/L氢氧化钠溶液定容至50 mL，备用。

1.4.2 标准曲线的绘制

分别吸取 0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL 氰化物标准中间液（1.0 μg/mL）置于10 mL具塞比色管中，用0.01 mol/L氢氧化钠溶液定容至10 mL，得到所配制的氰化物标准工作溶液的质量浓度分别为10、50、80、100、150、200 μg/L。用氰化物连续流动分析仪进行测定，以标准系列溶液为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.3 样品中氰化物含量计算

样品中氰化物含量计算公式如下。

X=（n×v）/m

式中：X为样品中氰化物的含量（以CN-计），mg/kg；n为根据标曲得出的氰化物浓度，μg/L；v为蒸馏出的体积，L；m为称取的样品质量，g。

1.4.4 精密度计算

选择3种不同地区的木薯粉作为试验对象，每种木薯粉样品设置平行试验7次，测定氰化物的含量，计算结果的精密度，其计算公式如下。

精密度/%=（S/A）×100

式中：S 为标准偏差，mg/kg；A 为平均值，mg/kg。

1.4.5 加标回收率计算

加标回收率计算公式如下。

加标回收率/%=（T-t0）/t

式中：T 为测量值，mg/kg；t0为本底值，mg/kg；t为加标量，mg/kg。

1.4.6 数据统计分析

数据采用Excel 2010计算平均值、标准偏差、精密度、标准曲线和加标回收率，用Origin 2019软件进行绘图和t检验分析测定2种试验方法结果的一致性。

2 结果与分析

2.1 方法试验条件的选择

2.1.1 水浴加热温度对显色试剂的影响

异烟酸和巴比妥酸两者皆易溶于热水以及碱性环境，加热温度的选择对异烟酸-吡唑啉酮显色试剂影响很大，若温度较低，试剂难以溶解，出现沉淀，如果温度过高，会改变其化学性质。所以本文探究不同温度条件下标准曲线的线性相关系数来探究最佳的温度条件。在不同的温度下，配制质量浓度分别为10、50、80、100、150、200 μg/L的氰化物标准工作溶液进行检测，结果见表1。

表1 不同温度对线性相关系数的影响Table 1 Effect of different temperatures on linear correlation coefficients

由表1可知，当水浴温度为60℃时，标准曲线的线性最好。所以后续研究选择水浴加热温度为60℃。

2.1.2 样品中氰化物提取液的选择

由于木薯粉中的氰苷非常不稳定，所以前处理试验对木薯粉中氰化物的提取特别重要。采用全自动水蒸气蒸馏仪进行氰化物蒸馏提取之前，需要在碱性环境下对样品中的氰化物进行提取[30]。如果氢氧化钠浓度过低，导致木薯粉中氰化物固定不完全；如果氢氧化钠浓度过高，CN-会生成CO2和N2，造成氰化物的损失，影响氰化物测量的准确性，故本文探究了不同氢氧化钠浓度对检测结果的差异，主要从氰化物加标回收试验进行考察，结果见表2。

表2 氢氧化钠浓度对氰化物检测结果的影响Table 2 Effect of concentration of sodium hydroxide on cyanide content

由表2可知，氢氧化钠浓度过高，碱性过强，木薯粉的糊化程度严重，会使检测结果降低，加标回收率降低；氢氧化钠浓度过低，会使氰化物提取不完全。所以为了检测结果的准确性和可靠性，以2 g/L的氢氧化钠作为提取液。

2.1.3 不同搅拌时间对氰化物测量结果的影响

为了使木薯粉中的氰化物充分溶解于提取液中，需要将木薯粉样品进行搅拌匀浆。氰化物属于挥发性物质，为了找到最佳的检测效果，本文探究了不同搅拌时间对木薯粉样品氰化物加标回收试验的影响，见图1。

图1 不同搅拌时间对加标回收试验的影响Fig.1 Effect of different stirring time on the spike/recovery assay

由图1可以看出，不同的搅拌时间对木薯粉中氰化物的测量结果影响不大，误差小于10%，所以为了整体的检测效率，提取时的搅拌时间选择10 min。

2.1.4 酒石酸用量对检测结果的影响

目前，对木薯粉中氰化物检测的基本原理是木薯粉中的氰化物在酸性条件下蒸馏出的氰化物用氢氧化钠溶液吸收，再与显色试剂反应比色定量。为了更有效地提取出样品木薯粉中的氢氰酸，所以试验中选取不同的酒石酸用量，考察酒石酸的不同用量对木薯粉中氰化物加标回收率的影响，结果见表3。

表3 酒石酸用量对加标回收试验的影响Table 3 Effect of tartaric acid dosage on the spike/recovery assay

由表3可知，酒石酸用量过高或过低，均会使加标回收率降低。当酒石酸用量为2.0 g时，加标回收率达到93.44%，检测结果最好，所以在前处理蒸馏试验中，选择加入2.0 g的酒石酸。

2.2 标准曲线的建立及方法检出限

设置对氰化物标准工作溶液浓度（0～200 μg/L），采用连续流动分析仪进行测定，以不同的标准工作液浓度（μg/L）为横坐标，以吸光度为纵坐标（Y），得线性方程y=0.004 53x+0.009 79，线性相关系数R2为0.999 5。并对空白样品进行11次重复测定，计算测定值3倍标准偏差得到该方法的检出限0.000 251 9 mg/L。当样品为5 g、蒸馏后定容体积为50 mL时，木薯粉样品中氰化物的检出限为0.013 mg/kg，定量限为0.043 mg/kg。

2.3 精密度测试

采用自主研发的全自动水蒸气蒸馏仪对样品进行蒸馏提取，再用连续流动分析仪进行测定，按照1.4.4计算结果的精密度，结果见表4。

表4 精密度试验结果Table 4 Results of precision assay

由表4可知，使用该方法测定结果的精密度小于10%，精密度良好，重复性好。

2.4 方法的加标回收率试验测试

选择3个浓度水平的氰化物标准溶液进行试验，对加标回收率进行测定，结果如表5所示。

表5 加标回收试验测量结果Table 5 Spike/recovery assay results

从表5可以看出，该方法测定结果的加标回收率为93.72%～103.33%，加标回收率符合国家标要准求，表明该方法准确度较高，满足氰化物检测要求。

2.5 与异烟酸-吡唑啉酮分光光度法的对比试验

异烟酸-吡唑啉酮分光光度法采用GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中的食品中氰化物的测定第一法进行，取6个样品，将所得的结果与本方法进行对照，结果见表6。

表6 方法的对照试验Table 6 Control trials of methods

由表6可知，对比数据的差异采用配对样本t检验，检测结果为 t=2.233 27，p=0.075 85（p＞0.05），在0.05水平下，两组数据没有显著差异，结果表现出较好的一致性。

3 讨论与结论

本文建立了全自动快速水蒸气蒸馏仪与氰化物连续流动分析仪联用方法，实现了对木薯粉中氰化物的提取与检测。全自动水蒸气蒸馏仪可自动加热，到达蒸馏终点自动关停。有效缩短蒸馏时间、提高检测效率。连续流动分析仪通过智能控制节约人力。检测结果表明，本方法精密度良好，加标回收率满足检测要求，而且提高了对木薯粉中氰化物的检测效率，并且该方法与GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中的分光光度法检测结果相一致，因此，可以满足木薯粉的检测需求。本方法实现了固体食品样品中氰化物含量检测，整个过程全自动化操作，简化了繁琐的操作过程，保证了方法的稳定性和检测结果的准确性。可以用于样品的大批量检测，为以后对于氰化物检测的一体化、集成化提供了研究依据。