花青素与大豆不溶性膳食纤维稳定体系优化构建及评价

孙肖振，陈冬霞，郭文睿，安玲玉，石镇铭，刘宇恒，贺阳，文连奎

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

花青素是存在于葡萄、蓝莓、紫甘蓝等果蔬的水溶性多酚类天然色素[1-3]，基本结构单元为3，5，7－三羟基-2-苯基并吡喃，其3、5、7位上的羟基可以与一个或多个单糖（葡萄糖、半乳糖等）、二糖（芸香糖等）或三糖等连接[4]，多以糖苷键形式存在，故又称花色苷[5]。花青素具有抗氧化、抗癌、降脂减肥及调节肠道菌群等功效[6-7]，但由于骨架上多个酚羟基的存在，使花青素易受温度、光照、pH值、氧气、抗坏血酸、金属离子等影响，出现褪色、变色、沉淀等现象，使其稳定性和生理活性降低，限制了花青素的应用，因此，提高花青素的稳定性尤为重要[8]。

近年来，提高花青素稳定性的研究已成为食品领域的研究热点，主要方法有微胶囊法、糖基酰化或与生物大分子之间通过相互作用形成复合物[9-13]。在花青素中添加蛋白质、淀粉、膳食纤维、果胶等大分子，通过氢键、疏水、金属配位、π-π堆积、静电和共价键相互作用与大分子结合[14]，形成较稳定的结构，可以起到对花青素的保护作用。

大豆不溶性膳食纤维（soybean insoluble dietary fiber，SIDF）含量约占豆渣（大豆榨油和传统豆制品加工主要副产物）干物质的45%，可占大豆豆渣总膳食纤维的90%。有研究表明膳食纤维能够与多酚类物质相互作用，提高其稳定性[15-16]。本文构建花青素纯化物（purified anthocyanins，ACN）与SIDF稳定体系并进行评价，以期为花青素稳定性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山葡萄（品种为“北冰红”）：通化市柳河县山葡萄产业服务中心；豆渣：山东嘉华保健品公司。

乙酸、乙醇、盐酸（均为分析纯）：北京化工厂；D101大孔树脂（分析纯）：天津市光复精细化研究所；高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；柠檬酸、磷酸氢二钠（均为食品级）：江苏瑞多生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温磁力搅拌器（HJ-3B）：博纳科技有限公司；紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；电子分析天平（CPA-125）：德国Sartourius公司；真空冷冻干燥机（LG0.2）：新阳速冻设备制造有限公司；离心机（KL04-A）：美国Agilent公司；高速冷冻离心机（JXN-26）：美国MARCAREG有限公司；电热恒温水浴锅（H.HS21.6）：上海医疗器械三厂；pH计（PHS-3D）：上海精科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

1.3.1.1 ACN的制备

参考贺阳[17]的方法制备ACN。山葡萄500 g打浆，用65%乙醇-1%盐酸提取剂进行提取[提取液：山葡萄液料比 5∶1（mL/g）]，在 55℃下以 100 r/min振荡30 min后，收集上清液，在45℃～50℃进行减压浓缩得到花青素粗提物。花青素粗提物通过D101大孔树脂进行纯化，洗脱速率为1.5 BV/h，洗脱剂为75%乙醇-0.01%盐酸。洗脱后的液体在45℃～50℃进行减压浓缩后得到花青素纯化物。采用pH示差法测定ACN（总花青素含量）≥25%。

1.3.1.2 SIDF的制备

参照Wang等[18]方法制备SIDF。取干豆渣10 g，加入蒸馏水进行稀释，料液比为1∶50（g/mL），然后进行连续的酶消化，首先加入1 mL热稳定的α-淀粉酶（0.25 g/mL），在 95℃～100℃条件下水浴 35 min，然后加入3 mL中性蛋白酶（0.125 g/25 mL），60℃水浴振荡30 min后，加入100 mL乙酸溶液（3 mol/L）调节pH值至4.5，最后加入4 mL淀粉葡萄糖苷酶（0.25 g/12.5 mL）进行30 min酶解。酶解完成后加入70℃蒸馏水静置2 h，在3 500 r/min条件下离心20 min，用5倍体积的95%乙醇沉淀12 h后进行真空抽滤，残留物进行冷冻干燥。选用100目～500目筛网对SIDF进行过筛，获取不同粒径的SIDF。

1.3.2 ACN-SIDF稳定体系构建流程

将适量ACN与SIDF按一定质量比，用pH3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100 mL（最终总花青素含量为12 mg/100 mL），按试验设计构建ACN-SIDF稳定体系，未经稳定处理的ACN溶液为对照。以吸光度和沉淀离心率为指标评价体系稳定效果。测定溶液沉淀30 min后在最大吸收波长521 nm处吸光度；同时称量离心管的质量，量取5 mL稳定溶液，加入离心管中，常温下6 000 r/min离心20 min，离心后倒掉上层液体，再将离心管倒置5 min后称重，按照下列公式测定稳定溶液的沉淀离心率。

沉淀离心率/%=（W2-W1）/（W3-W1）×100

式中：W1为离心管质量，g；W2为离心倒置后离心管加沉淀物的质量，g；W3为离心前样品加离心管的质量，g。

1.3.3 ACN-SIDF稳定体系构建单因素试验

在pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入适量ACN和SIDF，分别以ACN与SIDF质量比（1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50）、SIDF 粒径（100、200、300、400、500 目）、乳化温度（20、30、40、50、60 ℃）、乳化时间（10、20、30、40、50 min）为考察因素，最终用 pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100 mL（最终总花青素含量为12 mg/100 mL），每个因素水平试验时，其他因素以中间水平值为定值，避光恒温磁力搅拌后，将溶液静置30 min，测定λ521nm处的吸光度，常温下6 000 r/min离心20 min后，以吸光度和沉淀离心率为指标来评价体系稳定效果。

1.3.4 ACN-SIDF稳定体系构建正交试验

在单因素基础上，选取ACN与SIDF质量比、SIDF粒径、乳化温度、乳化时间4个因素进行L9（34）正交试验，以吸光度及沉淀离心率作为指标评价稳定效果，计算吸光度和沉淀离心率的权重系数，用于数据分析。

1.3.5 ACN-SIDF稳定体系稳定性评价

1.3.5.1 热稳定性

将ACN-SIDF稳定体系与ACN溶液分别置于玻璃管中用锡纸包裹，在（100±2）℃的水浴中热处理100 min，每隔20 min从水浴中取出后，立即放入冰水中冷却，在最大吸收波长处测定吸光度，以花青素保存率（retention rate，R）为指标，评价热稳定效果。根据下列公式计算花青素保存率。

R/%=A1/A×100

式中：A1为热、光处理后花青素的吸光度；A为热、光处理前花青素的吸光度。

1.3.5.2 光稳定性

将ACN-SIDF稳定体系与ACN溶液密封在玻璃瓶中，在室温（20±2）℃条件下光照（置于室内的窗台上，每天日照时间不少于 6 h）保存。分别于 0、5、10、15、20、25、30 d后取出样品。在最大吸收波长处测定花青素的吸光度，根据公式计算花青素保存率。

1.3.6 数据分析与处理

所有测试进行3次平行测定，结果取平行测定的平均值表示，使用SPSS 23版与Origin 2.19版软件对数据进行统计分析。

2 结果分析

2.1 ACN-SIDF稳定体系构建单因素试验结果分析

2.1.1 ACN与SIDF质量比对稳定体系的影响

ACN与SIDF质量比对稳定体系的影响见图1。

图1 ACN与SIDF质量比对稳定体系的影响Fig.1 Effect of ACN-SIDF mass ratio on the stable system

由图1可知，ACN与SIDF质量比为1∶30时，稳定体系在λ521nm处的吸光度达到最高水平0.872，而离心沉淀率最小0.846%，这可能是由于SIDF分散在溶液中与花青素发生分子间的交互作用，形成稳定的悬浮状液体。当SIDF比例逐渐升高时，过量的SIDF无法与ACN结合，产生沉淀，使吸光度呈下降趋势，沉淀离心率呈上升趋势。由于正交试验需设置3个不同水平，考虑到综合评分结果，选择ACN与SIDF质量比为1∶20、1∶30、1∶40进行正交试验。

2.1.2 SIDF粒径对稳定体系的影响

SIDF粒径对稳定体系的影响见图2。

图2 SIDF粒径对稳定体系的影响Fig.2 Effect of SIDF particle size on the stable system

由图2可知，SIDF粒径为200目～400目时，稳定体系的吸光度和沉淀离心率较好。当SIDF粒径为300目时，稳定体系在λ521nm处的吸光度达到较高水平，为0.862，而离心沉淀率最小0.815%，300目粒径的SIDF稳定效果最佳，可能是由于超微粉碎使SIDF颗粒细微化，并增大了SIDF的表面积，使更多的极性基团和水结合位点暴露在周围的水中，进而增加了SIDF与花青素的接触面积，使它们能紧密结合，从而降低沉淀离心率并增加吸光度[19]。当SIDF粒径目数逐渐增大，粉体过于细微化，出现疏水作用等排斥力，使得花青素无法与SIDF络合，并产生沉淀。因此，选择SIDF粒径为200、300、400目进行正交试验。

2.1.3 乳化温度对稳定体系的影响

乳化温度对稳定体系的影响见图3。

图3 乳化温度对稳定体系的影响Fig.3 Effect of emulsification temperature on the stable system

由图3可知，随着乳化温度的升高，吸光度呈下降的趋势，沉淀离心率整体呈逐渐上升的趋势。当乳化温度为30℃时，稳定体系在λ521nm处的吸光度达到较高水平，为0.869，而离心沉淀率最小0.818%。研究表明，疏水作用是一个吸热的过程，氢键作用是一个放热的过程，由于温度的不同，两种过程相互作用的比例也不同[20]。温度的变化对多酚与膳食纤维之间的相互作用有一定的影响，当乳化温度由20℃升高到30℃时，ACN与SIDF之间可能通过疏水相互作用结合，而当乳化温度逐渐升高，疏水键断裂，同时产生氢键相互作用[21]。因此，选择乳化温度为20、30、40℃进行正交试验。

2.1.4 乳化时间对稳定体系的影响

乳化时间对稳定体系的影响见图4。

图4 乳化时间对稳定体系的影响Fig.4 Effect of emulsification time on the stable system

由图4可知，乳化时间为30 min～50 min时，稳定体系的吸光度和沉淀离心率结果相对较好。当乳化时间为40 min时，稳定体系在λ521nm处的吸光度达到较高水平0.878，而离心沉淀率最小0.782%。当反应时间为20 min～40 min时，溶液的吸光度逐渐增加，沉淀离心率逐渐减小，表明反应时间的延长有利于提高稳定体系的互作效应。当反应时间继续延长，吸光度与离心沉淀率逐渐趋于平缓，表明反应时间的延长对反应效果影响逐渐减小，使其相互作用效应达到平衡。同时考虑到经济与稳定效果，选择乳化时间为30、40、50 min进行正交试验。

2.2 ACN-SIDF稳定体系构建正交试验结果分析

2.2.1 变异系数法分析

变异系数法是直接利用各项指标所包含的信息，通过计算得到指标的权重，是客观赋权的方法。通过赋予权重衡量稳定体系吸光度和沉淀离心率的相对重要性。

各个指标的变异系数按下列公式计算。

式中：Vi为第i项指标的变异系数；Si为第i项指标的标准差；Xi为第i项指标的算术平均值。

各个指标的权重按下列公式计算。

式中：Wi为第i项指标的权重；Vi为第i项指标的变异系数；为n项指标的和。

通过公式计算可知，吸光度的权重为0.475，沉淀离心率的权重为0.525。

采用SPSS 23版标准差标准化法将各指标标准化，结果见表1。在稳定体系指标标准化数值中，吸光度数值越大越好，沉淀离心率数值越小越好，对于指标越小越好的沉淀离心率测定值，标准化后需在数值前加负号。

表1 ACN-SIDF稳定体系指标标准化值Table 1 Standardized values of indicators of ACN-SIDF stable system

2.2.2 正交试验结果

将标准化后的数值与对应的权重相乘，计算各个指标的总合，得到各样品的综合评分，计算正交试验综合评分。正交试验因素水平及试验结果见表2。

表2 正交试验结果分析Table 2 Orthogonal experiment results

由表2可知，ACN与SIDF质量比（A）、SIDF粒径（B）、乳化温度（C）和乳化时间（D）对花青素稳定效果的综合评分最高组合为A2B1C2D3（综合评分为0.692）。由正交试验中极差R可知，各因素对ACN-SIDF稳定体系影响程度为C＞B＞A＞D，由K值可知，最优组合为A2B2C2D3，但考虑到较小的粒径能够提高SIDF的持水能力和比表面积，降低表面张力，并可以将更多的极性基团暴露在周围的水中，从而与花青素纯化物紧密结合，因此将稳定体系的最优组合调整为A2B2C2D3，即ACN与SIDF质量比1∶30、SIDF粒径300目、乳化温度30℃、乳化时间50 min。

稳定体系正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3方差分析可知，乳化温度对稳定体系有极显著影响（P＜0.01），ACN 与 SIDF质量比、SIDF粒径对稳定体系影响显著（P＜0.05）。

2.3 ACN-SIDF稳定体系稳定性评价结果与分析

2.3.1 热稳定性评价结果与分析

热处理对花青素保存率的影响见图5。

图5 热处理对花青素保存率的影响Fig.5 Effect of heat treatment on retention rate of anthocyanin

由图5可知，在100℃加热100 min后ACN-SIDF稳定体系与ACN溶液的花青素保存率分别为72.66%和56.85%，ACN-SIDF稳定体系的花青素保存率较ACN溶液提高了15.81%。结果表明，ACN-SIDF稳定体系具有较高的热稳定性，分析可能是生物大分子与酚类物质之间存在相互作用，如范德华力、氢键、静电相互作用和疏水作用等。这些相互作用使生物大分子与酚类物质结合，因此提高了酚类物质的热稳定性[22]。也可能是膳食纤维具有网状结构，能够吸附多酚类物质，从而保护多酚类物质在加热条件下的稳定性[22]。

2.3.2 光稳定性评价结果与分析

光照对花青素保存率的影响见图6。

图6 光照对花青素保存率的影响Fig.6 Effect of sunlight on retention rate of anthocyanin

由图6可知，在日光照射条件下贮藏30 d后，ACN-SIDF稳定体系和ACN溶液的花青素保存率分别为71.45%和54.89%。综合表明，SIDF可以延长花青素在日光条件下的保存时间，相较于ACN溶液，ACNSIDF稳定体系的花青素保存率提高了16.56%。环境条件对花青素稳定性具有重要的作用，SIDF对花青素有良好的保护效果。

3 结论

本试验通过正交试验，优化构建ACN-SIDF稳定体系并对其稳定性进行了评价，表明构建ACN-SIDF稳定体系的最优参数为ACN与SIDF质量比1∶30、SIDF粒径300目、乳化温度30℃、乳化时间50 min。在100℃水浴中热处理100 min，ACN-SIDF稳定体系花青素保存率为72.66%，较比ACN溶液提高了15.81%。在室温（20±2）℃、光照30 d条件下，稳定体系花青素保存率为71.45%，比ACN溶液提高了16.56%。综合试验结果表明，ACN-SIDF稳定体系中由于SIDF的加入明显提高了花青素的热稳定性和光稳定性。