哺乳动物精子获能信号通路及检测方法研究进展

毛 飞，程 敏，陈晓良，段 然，孙 洋，李国俊，王彩云

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古 包头 014109）

精子从雄性哺乳动物生殖系统生成并获得运动能力后，还需要在雌性动物生殖道中经历获能、顶体反应、精卵识别等过程才能完成受精。Chang［1］首次报道了哺乳动物精子可以在体外获能。精子获能与胆固醇含量和质膜稳定性等因素有关，涉及环磷酸腺苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）合成、cAMP 依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA）的激活和下游的酪氨酸磷酸化等。可以通过检测精子的sAC-cAMPPKA 通路、质膜流动性、胆固醇分布、酪氨酸磷酸化水平、顶体完整性和超活化水平判断其获能状态。精子体外获能对成功受精至关重要。充分了解精子获能过程中涉及的主要信号通路及精子获能的检测方法，对哺乳动物体外受精技术的成熟运用具有指导意义。笔者对哺乳动物精子获能过程中涉及的信号通路、信号分子、调节因子、离子通道以及精子获能检测方法的研究进展进行了综述，并对未来主要研究方向进行了展望，以期为精子体外培养及辅助生殖技术的应用等提供参考。

1 哺乳动物精子获能及涉及的信号通路

哺乳动物精子在雌性生殖道获能后发生了复杂的变化，包括一些重要的离子、蛋白改变以及形态的变化等。这些变化共同参与了信号通路及对应信号分子的功能修饰调节，为精子细胞获能和成功受精奠定了基础。

1.1 精子获能

根据Chang［1］的研究，当精子从雄性动物的生殖道释放出来时，它们并没有受精的能力。精子在雌性动物的子宫或输卵管内，经过一段时间的孵育，才能穿透透明带，与卵细胞融合，形成受精卵，这一过程为获能。绝大多数哺乳动物精子必须经历这一阶段才能顺利识别卵子并结合，从而实现受精。研究表明，在精子成熟过程中，精子表面的某些物质可能是抑制活力的失活因子，如蛋白质、肽等［2］，其能量学本质是去除或灭活精子表面的能量因素。精子获能包含一系列生理生化反应过程，其步骤大致如下。（1）超激活运动（hyperactivated motility，HAM）：精子鞭毛运动频率及运动方式发生转变。活力正常是哺乳动物精子在雌性生殖道内受精并与卵子融合的先决条件。适度的运动有助于精子进入卵子的透明带并与卵子结合形成受精卵。自从被发现以来，超激活运动已成为生殖研究领域的热点。（2）获能：精子质膜结构及特征发生变化。（3）顶体反应(acrosomal reaction，AR）：精子完成获能的必要前提［3］。

1.2 获能时精子的生理生化变化

精子获能过程中发生的生理生化变化会引起AR 和HAM，随后精子尾部振幅增加，鞭毛活动频率加快，运动趋势呈线性下降。获得受精能力的精子细胞进入卵母细胞透明带，完成受精。获能时精子发生的生理生化变化包括：（1）胆固醇流动引发质膜结构的改变，主要是质膜的通透性与流动性发生改变。（2）精子细胞内Ca2+和HCO3-浓度上升，使cAMP 水平升高。（3）蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）途径被激活并诱导部分精子蛋白的酪氨酸磷酸化，从而推动精子形成和AR 等重要过程［4］。

精子获能后期阶段发生的主要变化是与HAM和获能有关的酪氨酸磷酸化。由于该阶段精子的分化程度高，这些变化几乎不能改变精子基因的转录和翻译过程。精子获能与蛋白质磷酸化等反应之间存在密切联系［5］。酪氨酸磷酸化主要发生在丝氨酸（Ser）、冬氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上，但精子生成的状态也与同型酪氨酸磷酸化的程度有关。精子获能可分为2 种类型：快速事件和慢速事件，两者都发生在雌性生殖系统中。快速事件是指精子一离开附睾，鞭毛就猛烈而不对称地激活。其在分子水平上取决于PKA 的激活和腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶由Ca2+和HCO3-激活［6］。PKA 激活是由可溶性腺苷酸环化酶介导的，随着腺苷酸环化酶的激活，PKA 被激活。慢速事件涉及精子运动模式的变化。蛋白质的酪氨酸磷酸化是精子获能的另一个标志，发生在获能后期，与cAMP 和PKA 激活的时间不同。

1.3 精子“去获能”

研究表明，当精子发生获能和AR 时，精子质膜发生紊乱并进行重排以适应变化，没有与卵母细胞结合的精子会死亡。为了更好地防止这种不利于精卵结合情况的发生，当精子经过附睾时，附睾会分泌一些稳定因子附着在精子表面，这些稳定因子有利于精子质膜的稳定，保证精子在雌性生殖道中的存活。这些稳定因子称为去获能因子（decapacitation factor，DF）。精子获能是可逆的，当去能因子与已经获能的精子接触后，精子又变为未获能的状态，即“去获能”［7］。这种可逆性的调控除信号转导的参与外，还可能与精子自身的内在调节有关。当发生去获能反应时，精子质膜的流动性和通透性增加，精子质膜趋向更稳定的状态。精浆中的DF 也附着在精子表面，调节获能的可逆反应，使受精卵的数量减少，提高精子对外界环境的抵抗力，防止过早获能，但并不能阻止受精的发生［8］。研究表明，牛、猪、马、兔和猴等动物的精浆中均含有DF，而鸡和狗的精浆中不含有DF。

精子获能通常由能量底物、胆固醇、NaHCO3、Ca2+、K+和Na+组成。研究表明，小鼠精子获能的开始与胆固醇从精子质膜中的流出有关，这增加了质膜对Na+/HCO3-的渗透性，导致腺苷的激活、cAMP 的产生和PKA 的激活，从而促进精子获能［9］。全能酶PKA 由4 个亚单位组成，2 个亚单位是催化亚单位（PKA-C），另外2 个是亚单位调节亚基（PKA-R）。调节亚基中的R 亚基之间相互作用形成二聚体，另一端是cAMP 的结合位点。cAMP 与调节亚基的结合引发了催化亚基的解离和激活，可以激活G 蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）来调节精子获能［10］。有学者证实了酪氨酸磷酸化与精子获能的相关性，发现仓鼠、猪、马和刷尾负鼠的精子获能期间下游酪氨酸磷酸化水平提高［11］。PKA 抑制剂可以阻断酪氨酸磷酸化。研究表明，Src 家族蛋白酪氨酸激酶 （Srcfamily protein tyrosine kinase，SFK）可以调节小鼠、人和牛精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平［12］。在小鼠精子中发现PKA 与Src 家族共同免疫沉淀，这种相互作用导致Src 家族磷酸化［13］。Kumaresan 等［14］研究表明，输卵管液可以影响冻存猪精子获能过程中的酪氨酸磷酸化，母猪排卵前输卵管液诱导的磷酸化水平高于排卵后，公猪精子经过酪氨酸磷酸化后生育能力明显提高。蛋白质的酪氨酸磷酸化是由酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）调节的，而PKA 是调节TK 活性的最重要因素之一。目前发现2 种类型的TK，即受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）和非受体酪氨酸激酶（nonreceptor tyrosine kinase，NRTK）［15］。2004 年，研究人员证明了兔、小鼠、大鼠和人的精子中存在RTK。Src 家族的NRTK 主要分布于精子尾部［16］。后续研究发现，Src 家族也存在于人类精子的头部，应用特定的Src 家族和PKA 抑制剂可使合格精子蛋白质的酪氨酸磷酸化水平显著降低。最近对于人和小鼠精子的研究表明，大多数酪氨酸磷酸化蛋白位于精子尾部［17］。

1.4 去获能因子的分类

1.4.1 精子表面DF

精浆蛋白作为精浆的重要组成部分，不仅参与精子竞争、卵子生成和精卵结合，还参与精子获能、AR、抗氧化、免疫反应和受精等过程。研究表明，精子获能后生理功能和结构会发生变化，这些变化主要是由蛋白质的酪氨酸磷酸化、胆固醇从精子质膜流出、产生活性氧、精子质膜的超极化以及精子质膜内外离子浓度差等变化所致。

附睾、前列腺和精囊腺构成了雄性哺乳动物的附性腺。泌尿生殖腺分泌物是一种复杂的混合物，pH 值为7.35～7.50，可以保护精子免受雌性生殖道酸性环境的影响，是精子生存和进入雌性生殖道的必要条件。研究人员通过体外和体内培养从大鼠附睾尾部分离出的HongrES1 蛋白，发现该蛋白具有去能因子的特性。该蛋白被激活后，通过抑制抗血清（HA）而加速获得活性，HA 可诱导细胞外钙离子内流。然而，HongrES1 蛋白［幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP），0.25 mg/mL］能有效阻断细胞内钙离子通量，从而提高精子活力，防止生殖功能受损，避免后代胚胎发育异常［18］。

1.4.2 抑制蛋白质酪氨酸磷酸化的DF

研究表明，半胱氨酸分泌蛋白1（cysteine-rich secretory protein 1，CRISP1）抑制酪氨酸磷酸化，随着剂量的增加，磷酸化水平也越来越低，其通过影响精子头部质膜的磷酸化水平以及降低精子结合透明带和顶体胞吐能力来影响获能［19］。磷脂酶C（phospholipase C，PLC）参与精子获能并影响顶体细胞活性。活化后的PLC 与磷脂酰肌醇-PLC（PIPLC）通过参与胞质中膜磷脂酰肌醇4，5-双磷酸盐的水解，从而引起精子质膜的融合及AR。研究发现，人精液中存在PLC 亚型NYD-SP27，对蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）具有抑制作用，可以对精子过早获能与自发AR 起到负调控的功 能［20］。

2 精子获能的检测方法

根据获能精子在运动形态和新陈代谢等方面特点的变化，创设了多种精子获能的评价方法和标准体系。目前比较常用的检测方法有sACcAMP-PKA 通路检测、质膜流动性改变检测、胆固醇再次分布检测、酪氨酸磷酸化检测和AR 等。此外，还有去能因子鉴定、精子呼吸能检测等方法。由于测定呼吸能的方法有许多弊端，所以现在已经淘汰。

2.1 sAC-cAMP-PKA 通路检测

在早期研究中，通常使用放射性酶或免疫分析法检测可溶性腺苷酸环化酶 （soluble adenylate cyclase，sAC）和PKA 的活性以及cAMP 的产量。对于酶的检测，通常使用sAC 或PKA 活性修饰的放射性标记底物，利用电离辐射仪器检测产物。研究表明在小鼠精子中，利用放射性试验测定不同条件下sAC 的活性，将内源性sAC 底物［α-32P］ATP转化为［32P］cAMP，然后经过层析纯化测定产物水平［21］。在小鼠精子获能过程中，利用PKA 磷酸化将放射性的磷酸盐转移到激酶底物肽（肯普肽）上测定sAC 的活性［22］。cAMP 的免疫检测方法是将放射性标记的cAMP 和内源性精子cAMP 竞争性地结合在抗cAMP 抗体上，从而检测抗体的含量。这种测定cAMP 含量的方法，已经应用于野猪、牛和人等物种的精子获能检测［23］。

2.2 质膜流动性改变检测

由cAMP-PKA 依赖磷脂的流动引起的质膜流动性变化已被广泛研究，许多早期研究以公猪为模型物种［24］。研究表明，部花青540（merocyanine 540，荧光染料）在质膜的流体相中具有很高的结合亲和力，成为检测脂质堆积程度的敏感工具。用碳酸氢盐处理猪精子后，精子质膜结构快速变化，用流式细胞仪检测到精子中的部花青540着色增强。用部花青540 检测精子质膜早期的快速变化已经应用于公羊、马和犬等动物［25］。

2.3 胆固醇再次分布检测

随着cAMP-PKA 依赖的磷脂转运的激活和细胞膜流动性的增加，在质膜中均匀分布的胆固醇集中到精子头部顶端［26］。研究发现，利用Filipin标记技术可以直观地观察到胆固醇向精子头部运动，Filipin 是由链霉菌产生的多聚体类化合物，最常用的亚型是Filipin Ⅲ型。这种蛋白异构体能够与细胞膜内的内源性胆固醇形成复合物，具有荧光特性［27］。该技术已应用于猪、马等动物的精子获能检测。

2.4 酪氨酸磷酸化检测

有2 种常见的方法用于检测精子蛋白质的酪氨酸磷酸化：一种是免疫荧光法，另一种是免疫印迹法。免疫荧光法使用荧光基团，如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）与酪氨酸磷酸化的蛋白质结合，实现磷酸化蛋白质的定位［28］。这种方法能直观地看到获能过程中蛋白质磷酸化的变化以及不同功能之间的联系。研究表明，用15%的抗酪氨酸标记小鼠精子后，在荧光未激发时显示部分或全部荧光。精子被激发并与卵子透明带接触时，荧光完全转向鞭毛的精子占90%。免疫荧光被用来区分无法与输卵管细胞结合的精子，依据是它们在赤道区域和顶体区域发生磷酸化。鉴定特异性磷酸化的蛋白质只能通过免疫印迹（Western blotting）。精子蛋白磷酸化的分析已被广泛用于几个物种中。对酪氨酸磷酸化的免疫印迹和免疫荧光分析筛选出了小鼠精子中的2 种分子伴侣，即热休克蛋白60 和90 家族ERP99 蛋白，它们只在受精条件下被磷酸化，并与精子区域识别有关。为了更全面地分析精子的蛋白质，可以在蛋白质转移之前用2D-SDS-PAGE 进行分离，随后用串联质谱法检测凝胶中的分离蛋白［29］。

2.5 顶体完整性检测

除上述方法外，显微镜观察法也是研究获能的一种手段，用来检查获能精子中顶体的变化。金霉素（CTC）试验是一种利用荧光评估顶体反应的方法，已被用于多种动物（马、羊和犬）精子激活的各个阶段的检测。CTC 可与细胞膜上的Ca2+结合，目前还没有明确的机制可以解释其在激活过程中的分子水平分布［30］。在获能成功后，量化顶体变化的最常见方法之一是使用凝集素或抗体在细胞外暴露后与顶体膜结合。顶体外膜的暴露使糖基化的蛋白质很容易与特定的凝集素或针对荧光体的抗体结合，因此，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测新暴露的糖蛋白的表达和分布。有许多凝集素能够检测顶体反应，而且每种凝集素都有不同的效果。花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）是一种经常用于检测顶体反应的凝集素。与细胞表面补体调节蛋白（CD46，位于顶体膜内）的抗体相比，PNA 已被证明具有更好的结合能力，并且不影响精子活力或质膜的完整性。由于顶体囊泡扩散暴露了顶体内膜，PNA 比顶体囊泡的抗体CRB9和豌豆凝集素能更好地捕捉人类精子的顶体反应速度［31］。

2.6 精子超激活

精子过度激活是受精能力的特征之一。最初，研究人员通过显微镜图像观察一段时间内可识别的超激活运动特征来确定表达该运动的精子百分比，或通过手动重建精子运动轨迹来确定精子超激活的具体运动参数。运动参数可以从不同角度解释高活性精子的运动轨迹，特别是精子头部侧摆 幅 度 （amplitude of lateral head displacement，ALH）和低速直线曲线（curvilinear velocity，VCL）。由于技术创新，计算机辅助精液分析（computerassisted sperm analysis，CASA）已经取代了人工重建精子运动能力分析，并且比人工重建更加客观。研究表明，不同物种精子的超活化现象差异很大，这可能与鞭毛结构不同有关，因此，不同物种有不同的精子过度活跃的阈值和运动能力参数［32］。研究表明，过度活跃的公猪精子的ALH＞3.5 μm、VCL＞97 μm/s 和LIN（linearity）＜32%，而公羊精子则极为活跃，ALH＞9 μm，VCL＞250 μm/s，LIN≤30%［33］。

3 小结与展望

哺乳动物精子获能是受精过程的一个关键组成部分，可以衡量精子与透明带结合并使卵细胞受精的能力。精子获能涉及许多种复杂的生理生化反应，其中，cAMP 和酪氨酸磷酸化受PKA 介导的信号调节。影响精子生成的因素包括各种离子的变化、质膜蛋白的重组、膜磷脂的代谢、胆固醇水平、顶体反应和过度激活。随着胚胎工程技术的进步以及各相关学科的发展与融合，精子获取技术将取得新的突破，精子生育能力评估技术将不断创新。