硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位抗氧化性能的影响

阴禹舟，王 勃，夏方山，王聪聪，陈奕霖，赵 萍

（山西农业大学草业学院，山西 太谷 030801）

硒元素是人和动物的必需微量元素，硒缺乏与克山病和大骨节病的易感性有着密切关系［1］。硒可促进植物新陈代谢，在植物生长发育过程中发挥着重要作用，硒的合理使用有助于提高种子质量［2-3］。人类和动物体内无法合成硒且易于代谢，人类和动物摄取硒的重要来源是通过膳食摄入植物富集的土壤无机态硒，因此，土壤中的有效硒含量对人和动物的健康具有至关重要的作用［4］。土壤中硒的有效性在世界上大多数地区都处于较低水平，容易导致人体硒缺乏［5-6］。我国有近72%的区域存在着不同程度的缺硒现象，黄土高原中北部缺硒尤为严重，其土壤硒含量低于0.1 μg/g，致使该地区的人和动物易患缺硒疾病［7-9］。

生物富硒不仅可以有效提高植物的产量和品质，还能满足人体对硒的营养需求［10］。人体对硒需求水平的安全范围非常窄，摄入量低于需求水平的1/10 就会引起硒缺乏疾病，而摄入量超过需求水平的10 倍则会引起硒中毒，因此，在富硒农产品生产中需谨慎控制硒浓度和处理时间［11］。目前，硒元素在农业生产中的主要施用方法有土壤施肥和叶面喷施，而种子引发的方式相对少见［12］。传统的土壤施肥方式使用的微肥量较低且难以撒施均匀，植物根系对所缺乏微肥的需求无法通过叶面施肥的方法快速缓解。上述2 种施肥方式人力以及物力投入较大，使得微肥综合施用的效益大幅降低，而种子引发可以避免这些方法的限制［13］。种子引发是通过控制种子缓慢吸水和后期回干，使种子胚根达到即将突破种皮时的早期萌发状态，为萌发提前进行生理准备的一种播前种子处理技术，因其简单安全，在微量元素施用中具有广泛的应用前景，已发展为一种经济有效、操作简单的施肥替代方法，成为富硒农产品生产中基本的生物策略［14-15］。硒引发可以促进植物尤其是幼苗的生长，大幅增强植物的抗氧化能力以及抗逆性等，从而提高植物的产量和品质［16］。然而硒引发对植物影响的研究仍然较少，严重制约着其在生产实践中的推广应用。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）不仅具有产量高、再生能力强、营养价值高和良好的生态价值等特点，而且具有良好的适口性和高消化率，是优质牧草品种和饲料作物［17-18］。硒作为动植物生长发育的必需微量元素，不仅可以预防某些疾病的发生，而且在生产中发挥着极其重要的作用［19-20］，因此，大规模生产高品质富硒紫花苜蓿也越来越受到关注。在传统植物生产中直接添加硒往往会出现不可避免的不良现象，如高毒性、摄入不均匀及生物利用率低等［21-22］。目前，富硒苜蓿产品以土壤施肥、叶面喷施等方式为主，紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力可通过土壤施硒肥的方式得以提高，从而促进紫花苜蓿的生长［21］。研究发现，硒引发可以提高紫花苜蓿种子的抗氧化能力［23］。然而关于外源硒引发对紫花苜蓿幼苗不同部位抗氧化能力的影响尚不清楚，所以利用种子引发技术进行富硒紫花苜蓿生产有待进一步研究。该研究旨在通过评价0.5 mmol/L 的亚硒酸钠溶液引发条件下，不同引发时间对紫花苜蓿幼苗各部位抗氧化能力的影响，以期为发展高效富硒紫花苜蓿生产和进一步提高紫花苜蓿栽培管理水平提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

紫花苜蓿种子由山西农业大学草类植物育种与种子科学实验室提供。供试的紫花苜蓿品种为偏关苜蓿，2018 年在山西农业大学草业科学校内试验站收获，密封保存于-20 ℃环境中，试验于2021 年3 月进行。

1.2 引发处理

挑选均匀饱满的紫花苜蓿种子，浸入浓度为0.5 mmol/L 的亚硒酸钠溶液中，于20 ℃的环境中分别处理0、3、6、9、12 h，确保种子完全浸入溶液。引发结束后用蒸馏水冲洗种子3 次，并快速将其表面水分用滤纸吸干，移至黑暗环境（温度为25℃、空气相对湿度为45%）中自然风干，待含水量约为鲜重基础的10%时，4 ℃密封保存，备用。每个处理挑选均匀饱满的种子100 粒，放入铺有2 层滤纸的培养皿中，于20 ℃恒温光照培养箱中培养10 d，每个处理重复4 次。

1.3 抗氧化性能指标测定

取紫花苜蓿整株幼苗、子叶及胚根各0.1 g，参照Kibinza 等［24］报道的方法进行粗酶液提取，上清液于4 ℃保存备用。参照Rao 等［25］报道的方法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，参照Nakano 等［26］报道的方法测定抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，参照Aebi［27］报 道 的 方 法 测 定 过 氧 化 氢 酶（catalase，CAT）活性，参照Madamanchi 等［28］报道的方法测定谷胱甘肽还原酶 （glutathione reductase，GR）活性，参照Bailly 等［29］报道的方法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.4 数据处理

应用Excel 2016 软件对试验数据进行初步整理，用SPSS 26.0 统计学软件进行单因素方差分析，组间均数多重比较使用Duncan＇s 法，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。试验结果以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位SOD活性的影响

由图1 可知，在不同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的SOD 活性均随引发时间的增加呈升高趋势；整株、子叶及胚根的SOD活性均在引发0 h 时最低，在引发12 h 时最高，且整株、子叶及胚根的SOD 活性在不同引发时间差异显著（P＜0.05）。在相同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的SOD 活性存在差异，5 个引发时间下胚根的SOD 活性均显著（P＜0.05）高于子叶和整株，其大小顺序为胚根＞整株＞子叶。

图1 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位SOD 活性的影响

2.2 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位CAT活性的影响

由图2 可知，在不同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的CAT 活性均随引发时间的增加呈升高趋势；整株、子叶及胚根的CAT活性均在引发0 h 时最低，在引发12 h 时最高，且整株、子叶及胚根的CAT 活性在不同引发时间差异显著（P＜0.05）。在相同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的CAT 活性存在差异，5 个引发时间下胚根的CAT 活性均显著（P＜0.05）高于子叶和整株，其大小顺序为胚根＞整株＞子叶。

图2 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位CAT 活性的影响

2.3 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位APX活性的影响

由图3 可知，在不同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的APX 活性均随引发时间的增加呈升高趋势；子叶的APX 活性在引发0、3 h 时显著（P＜0.05）低于其他引发时间，在引发12 h 时显著（P＜0.05）高于其他引发时间；胚根和整株的APX 活性在引发0 h 时最低，在引发12 h时最高，且胚根和整株的APX 活性在不同引发时间差异显著（P＜0.05）。在相同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的APX 活性存在差异，5 个引发时间下胚根的APX 活性均显著（P＜0.05）高于子叶和整株，其大小顺序为胚根＞整株＞子叶。

图3 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位APX 活性的影响

2.4 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位GR活性的影响

由图4 可知，在不同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的GR 活性均随引发时间的增加呈升高趋势；子叶的GR 活性在引发0 h时显著（P＜0.05）低于其他引发时间，在引发12 h时最高；胚根和整株的GR 活性均在引发0 h 时显著（P＜0.05）低于其他引发时间，在引发12 h 时最高，其中，整株的GR 活性在引发12 h 时显著（P＜0.05）高于其他引发时间。在相同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的GR 活性存在差异，5个引发时间下胚根的GR 活性均显著（P＜0.05）高于子叶和整株，其大小顺序为胚根＞整株＞子叶。

图4 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位GR 活性的影响

2.5 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位MDA含量的影响

由图5 可知，在不同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的MDA 含量均随引发时间的增加呈先升高后下降趋势；子叶的MDA 含量在引发12 h 时最低，显著（P＜0.05）低于引发0、3 h处理；整株的MDA 含量在引发3 h 时升至最高，在引发6 h 时MDA 含量出现下降，在引发12 h 时MDA 含量降至最低，显著（P＜0.05）低于引发0、3、6 h 处理；胚根的MDA 含量在引发3 h 时升至最高，在引发6 h 时MDA 含量出现下降，在引发12 h时MDA 含量降至最低，显著（P＜0.05）低于其他引发时间。在相同引发时间处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的MDA 含量存在差异，5 个引发时间下胚根的MDA 含量显著（P＜0.05）高于子叶和整株，其大小顺序为胚根＞整株＞子叶。

图5 硒引发时间对紫花苜蓿幼苗不同部位MDA 含量的影响

3 讨论

抗氧化酶系统对胁迫的响应是植物抵御逆境伤害的关键机制之一，由SOD、CAT、APX 和GR等协同作用，清除细胞内过量积累的活性氧［30-31］。硒是植物体内重要的微量元素，主要作用是作为抗氧化物质的成分参与抗氧化作用［32-33］。在没有SOD 催化时，硒能够刺激O2-自发歧化成H2O2，并且硒化合物对O2-具有直接清除作用［34］。硒对植物幼苗各部位的作用主要表现在提升其抗氧化能力方面［35］。该研究中，在浓度为0.5 mmol/L 的亚硒酸钠溶液引发处理下，紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化酶活性表现出随着引发时间的延长而上升的趋势，在引发处理12 h 时达到最高，这与夏方山等［23］报道的硒引发对紫花苜蓿种子抗氧化性能影响的研究结果相似，说明紫花苜蓿种子及幼苗的抗氧化酶活性随着硒引发时间的增加而提高。外源硒通过增加植物各部位抗氧化酶的活性，使得幼苗对活性氧的清除能力提高［36］。SOD 是植物体内参与活性氧清除的一种重要酶，在抗氧化酶系统中占据核心地位［37］。该研究中，随着硒引发时间的增加，紫花苜蓿幼苗不同部位的SOD 酶活性逐渐增加，这与硒处理下SOD 基因转录水平增加密切相关［38］。SOD 将有害的O2-转化成H2O2以减轻对植物的伤害，同时，APX、GR 与CAT 等组成抗氧化酶系统发挥协同作用，清除H2O2［39］。MDA 是植物体内脂质过氧化的标志性产物，膜结构受损状况可通过MDA 含量反映。细胞中活性氧的大量积累会引起脂质过氧化，从而造成MDA 含量上升；细胞内抗氧化酶系统被激活是因为细胞膜结构受到MDA 胁迫，从而增强细胞的抗氧化能力［40-42］。该研究中，在硒引发0～3 h 时，随着硒引发时间的延长，紫花苜蓿幼苗各部位细胞内O2-不断积累，加剧了脂质过氧化，各部位细胞中MDA 含量逐渐增加，刺激抗氧化酶活性不断升高，清除活性氧的能力加强；在引发3 h 后，抗氧化酶系统及时清除过量的O2-，缓解脂质过氧化，MDA 含量降低，在引发12 h 后紫花苜蓿幼苗不同部位的MDA 含量降至最低，说明硒引发可在一定程度上缓解紫花苜蓿幼苗不同部位细胞的脂质过氧化，保护生物膜系统，有利于紫花苜蓿种子的萌发。研究表明，硒引发能够降低油菜（Brassica campestris）幼苗根系中MDA 含量，有利于幼苗根系的生长，而基施少量的硒肥也能使紫花苜蓿叶片的MDA 含量降低，这可能与抗氧化酶活性的升高有关［43］。

硒引发可以提高紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化能力。该研究中，在相同的硒引发时间下，紫花苜蓿幼苗胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性显著（P＜0.05）高于其他部位，表明硒引发可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，这有利于紫花苜蓿胚根生长，并促进其萌发。胚根是种子萌发时最先生长的部位，最容易受到环境的影响。随着硒引发时间的增加，紫花苜蓿幼苗胚根抗氧化酶的活性始终高于其他部位，说明硒引发可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，有利于幼苗胚根保持活力从而应对外界环境的变化。此外，在相同的硒引发时间下，紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量也显著 （P＜0.05）高于其他部位，这说明幼苗在生长过程中，最先长出的胚根较容易受到损伤。与其他引发时间相比，在引发12 h 时紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量最低，说明幼苗胚根细胞的脂质过氧化水平由于硒引发而降低，有利于紫花苜蓿幼苗的生长。

4 结论

硒引发对紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影响与其部位和引发时间有关。紫花苜蓿幼苗整株、子叶及胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性随着硒引发时间的增加而上升，而MDA 含量的变化趋势相反。硒引发对紫花苜蓿幼苗子叶的影响最小，对幼苗胚根的影响最大。硒引发浓度为0.5 mmol/L、引发时间为12 h 时效果最佳。