新疆某养殖场腹泻仔猪奇异变形杆菌的分离鉴定、药物敏感性试验及毒力基因检测

胡延波，车丽妍，王超男，于 娜，李 静，李 平，井 波，齐 萌

（塔里木大学动物科学与技术学院/新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是革兰阴性杆菌，有鞭毛，多呈短杆状或丝状，广泛分布于自然环境、人和动物黏膜及消化道中，主要引起人和动物腹泻、尿道炎和肾盂肾炎，可导致宿主菌血症和败血症［1-2］。猪感染该菌后出现精神沉郁、厌动喜卧、食欲减退、体温升高、腹泻和呕吐等临床症状，严重时可造成败血症导致死亡［3］。近年来，奇异变形杆菌感染的病例在规模化猪场时有发生，造成一定经济损失。Chinnam 等［4］采集印度安得拉邦克里希纳区及其周边地区163 份猪直肠拭子，采用形态学观察和PCR 法分离鉴定出9 株奇异变形杆菌，分离率为5.52%（9/163）；Qu 等［5］采集浙江省9 个养殖场的541 份猪直肠拭子，采用形态学观察和PCR 法分离鉴定出30 株奇异变形杆菌，分离率为5.55%（30/541）；刘妍罕等［6］自贵州省15 份野猪肝脏样本中分离出6 株奇异变形杆菌，对多种抗菌药物呈现不同程度耐药；葛强等［7］报道自广西壮族自治区98 份病死猪病料样本中分离鉴定出21 株奇异变形杆菌，均表现多重耐药。该研究旨在分离鉴定新疆维吾尔自治区某规模化养殖场腹泻仔猪粪便中的奇异变形杆菌，对其进行药物敏感性试验及毒力基因检测，以期为猪奇异变形杆菌病的防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 腹泻仔猪粪便的采集

2021 年12 月，新疆维吾尔自治区阿克苏地区某规模化猪场 （存栏800 头母猪）25 日龄仔猪出现水样腹泻，使用无菌棉拭子经肛门采集4 头仔猪的粪便样本，置于1.5 mL 无菌离心管内，送至实验室，24 h 内进行细菌培养。

1.1.2 主要试剂

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨固体培养基（TSA）和木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye），购自北京全式金生物技术股份有限公司；DL 2 000 DNA Marker，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。革兰染色液参考《兽医微生物学实验指导》［8］配制。

1.1.3 主要仪器设备

PCR 仪为美国Bio-Rad 公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪为北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统为美国ProteinSimple 公司产品；微量移液器为德国Eppendorf 公司；台式高速离心机为湖南赫西仪器装备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离与形态学观察

将无菌采集的4 份腹泻仔猪粪便分别接种于TSB 液体培养基中，37 ℃培养24 h 后，蘸取菌液在XLD 培养基上进行划线分离接种；37 ℃培养24 h 后，挑取单个菌落在TSA 培养基进行纯化培养。纯化后，肉眼观察菌落形态结构，挑取单个菌落，进行革兰染色，采用普通光学显微镜观察细菌的形态结构，参考《伯杰氏系统细菌学手册》（第八版）进行形态学观察与鉴定。

1.2.2 分离菌株基因组DNA 的提取及SSU rDNA 的PCR 扩增

挑取纯化后的单个菌落，置于TSB 液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h 后，在超净工作台中吸取1 mL 菌液，置于灭菌处理过的1.5 mL 离心管内，按照细菌基因组DNA 提取试剂盒操作步骤提取细菌DNA。

参考苏治国等［9］报道的细菌核糖体小亚基（ribosomal small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因（SSU rDNA）通用引物序列进行设计，上游引物序列为：5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3＇，下游引物序列为：5＇-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3＇，目的片段为1 400 bp，引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。PCR 反应体系为25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，浓度为20 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延 伸2 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。以高压灭菌的双蒸水作为阴性对照，PCR 扩增结束后，取5 μL产物通过10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统内拍照保存。

1.2.3 分离菌株的SSU rDNA 序列分析及系统发育树构建

将PCR 阳性产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序，将所获细菌的SSU rDNA序列进行拼接后，在NCBI 数据库中进行BLAST搜索，根据序列比对结果，鉴定细菌种类。从NCBI数据库中下载与分离菌株序列同源性较高的奇异变形杆菌、潘氏变形杆菌（Proteus penneri）和豪氏变形杆菌（Proteus hauseri）等细菌的SSU rDNA 序列，以我国新疆双峰驼源肺炎克雷伯菌（GenBank登录号：KT361422）的SSU rDNA 序列为外群序列，使用MEGA 7.0 软件，邻接法构建菌株的系统发育树，其可靠性用Bootstrap 分析检测，进行1 000个重复。

1.2.4 分离菌株的毒力基因检测

参考苏治国等［9］报道的细菌毒力基因ureC、pmfA、zapA、mrpA、atfA、atfC 和ucaA 进行引物设计，引物由苏州金维智生物科技有限公司合成，引物序列、退火温度和目的片段见表1。PCR 反应体系为25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，浓度为20 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。反应条件同“1.2.2”项下。PCR 扩增结束后，取5 μL 产物通过10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统内拍照保存。

表1 细菌毒力基因的引物序列、退火温度和目的片段

1.2.5 分离菌株的药物敏感性试验

分别取分离纯化后的菌液100 μL，在MHA 培养基上均匀涂布，将12 种药敏片紧贴于平板上，37 ℃培养12 h，参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物药物敏感性试验标准，根据抑菌圈大小对分离菌株进行药物敏感性试验结果判断［10］。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态学观察

在XLD 培养基上，有3 株分离菌呈淡黄色菌落，四周平滑，有光泽，中心呈黑色（见图1A）；挑取单菌落进行革兰染色，普通光学显微镜下观察，可见细菌呈红色，为两端钝圆和短杆状的革兰阴性菌（见图1B）。经形态学观察，初步鉴定分离株属变形杆菌属。

图1 分离株形态学观察结果

2.2 分离菌株SSU rDNA 的PCR 扩增

基于细菌通用SSU rDNA 引物，对3 株分离菌的基因组DNA 样本进行PCR 扩增，结果显示，均成功扩增出1 400 bp 左右的片段，与目的片段大小一致（见图2）。

图2 基于细菌SSU rDNA 的PCR 扩增结果

2.3 分离菌株SSU rDNA 的序列分析和种类鉴定

3 株细菌分离株SSU rDNA 的PCR 产物经测序、序列比对和BLAST 搜索，与我国广东省狞猫源奇异变形杆菌分离株SSU rDNA 序列（GenBank登录号：CP053718）同源性均为100%，与印度家蝇源奇异变形杆菌分离株序列（GenBank 登录号：HQ407319）、我国深圳猪源奇异变形杆菌分离株序列（GenBank 登录号：KF051776）和我国新疆牛源奇异变形杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：JQ975907）同 源 性 分 别 为99.70%、99.90% 和100%。结合形态学观察结果和序列比对结果，3 株分离菌均鉴定为奇异变形杆菌。

2.4 奇异变形杆菌分离菌株SSU rDNA 序列的系统发育树

基于SSU rDNA 构建的种系进化树发现，该研究所获奇异变形杆菌序列与我国云南省猪源、河北省猪源、河南省鸡源、黑龙江省牛源、黑龙江省貂源、广东省狞猫源和印度山羊源奇异变形杆菌的序列同处于一个进化支，形成一个亚群分支；与我国深圳猪源、加拿大牛源、哥伦比亚人源奇异变形杆菌的序列存在亚群分化；其他种类变形杆菌聚类形成一个进化支；提示猪源奇异变形杆菌可能存在一定的遗传变异（见图3）。

图3 奇异变形杆菌分离菌株基于SSU rDNA 序列构建的系统发育树

2.5 奇异变形杆菌分离菌株的毒力基因检测

采用PCR 法检测3 株分离菌的7 个毒力基因，结果显示，3 株分离株均能扩增出ureC（375 bp）、pmfA（534 bp）、zapA（493 bp）、mrpA（410 bp）、atfA（365 bp）、atfC（472 bp）和ucaA（587 bp）基因条带，目的片段大小与预期一致（见图4）。

2.6 奇异变形杆菌分离菌株的药敏试验结果

根据CLSI 药敏试验判定标准，3 株奇异变形杆菌分离株均对诺氟沙星、麦迪霉素、红霉素、多黏菌素B、复方新诺明、克林霉素、庆大霉素、氯霉素、头孢噻吩、四环素和米诺环素产生了耐药性；分离株2 和分离株3 对头孢西丁敏感，分离株1呈中介（见表2）。

表2 奇异变形杆菌的药物敏感性试验结果

3 讨论

近年来，有关奇异变形杆菌多重耐药菌株的报道中，除对呋喃妥因、四环素和多黏菌素天然耐药外，对β-内酰胺类、喹诺酮类药物的耐药性也不断增多［11］。黎娜铭等［12］调查发现贵州省野猪源奇异变形杆菌对庆大霉素、诺氟沙星和氯霉素等药物敏感，对氨苄西林、头孢唑林、头孢拉定、四环素、多西环素、呋喃唑酮等6 种药物呈现不同程度耐药；邓红玉等［13］调查发现福建省猪源奇异变形杆菌对四环素和诺氟沙星敏感，对阿米卡星、复方新诺明、红霉素、卡那霉素、青霉素、链霉素、奥复星等7 种药物呈现不同程度耐药；马婷婷等［14］调查发现广西壮族自治区猪源奇异变形杆菌对头孢西丁、头孢他啶、大观霉素、氨曲南等药物敏感，对庆大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21 种药物呈现不同程度耐药。该研究发现，分离到的3 株奇异变形杆菌均对诺氟沙星、麦迪霉素等11 种药物产生了不同程度耐药性，分离株2 和分离株3 对头孢西丁敏感，分离株1 对头孢西丁呈中介。研究结果提示不同地区猪源奇异变形杆菌耐药性存在一定差异，应结合该地区的具体养殖用药情况，及时采集病料进行实验室诊断和药敏试验，进行针对性用药。

尹有勤等［15］调查发现，通辽地区1 株猪源奇异变形杆菌携带8 种毒力基因，分别为ureC、zapA、mrpA、ucaA、pmfA、atfA、atfC 和rsbA；Sun 等［16］从东北地区犬、貂、牛和家禽等4 种动物的614 份腹泻粪便样本中分离鉴定176（28.66%）株奇异变形杆菌，其中162（92.05%）株分离菌具有生物膜，其致病力明显强于无生物膜的分离菌，研究结果发现，奇异变形杆菌生物膜的形成与ureC、zapA、rsmA、hmpA、mrpA、atfA 和pmfA 等 基 因 显 著 相关。该研究检测发现，分离鉴定的3 株猪源奇异变形杆菌携带7 种毒力基因，其中ureC、zapA、pmfA、mrpA 和atfA 等5 种毒力基因均与生物膜形成相关，提示具有较强的毒力。

4 结论

该研究自新疆某养殖场腹泻仔猪粪便样本中分离到3 株奇异变形杆菌。分离菌携带7 种毒力基因，具有多重耐药性。研究结果提示该养殖场应合理用药，加强对仔猪奇异变形杆菌病的防治。