新疆阿克苏地区蜱和羊感染无浆体的分子流行病学调查

刘凯强，俞 进，段真真，金 敏，李 佳，巴音查汗·盖力克

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区阿克苏市动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000）

蜱是一种常见的专性吸血的体外寄生生物，寄生在宿主的体表能够引起严重的自然疫源性疾病，携带和传播无浆体、立克次体等多种病原，部分病原具有人畜共患特点，对畜牧业生产和公共卫生安全造成了极大的危害［1-2］。

无浆体病 （anaplasmosis）是由立克次体目（Rickettsiales）无浆体科（Anaplasmataceae）无浆体属（Ananlasma）成员引起的一类常见的血液性寄生虫病，该属病原在脊椎动物的血细胞内广泛存在，羊比较常见的病原有绵羊无浆体（Ananlasma ovis，A.ovis）和 嗜 吞 噬 细 胞 无 浆 体（Ananlasma phagocytophilum，A.phagocytophilum）等［3-5］。羊感染无浆体后临床症状为食欲减退、消瘦、高热、黄疸，严重时可导致感染动物的死亡［6-8］。为了解新疆阿克苏地区蜱虫与羊感染无浆体的情况，笔者在该地区采集了蜱和羊抗凝血样品，首先对蜱虫进行形态学观察，再利用分子生物学方法进行种类鉴定，同时，使用PCR 方法检测媒介蜱和羊感染无浆体的情况，以期为该地区科学防控无浆体病提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

在新疆阿克苏地区各县（市）采集羊抗凝血样品477 份，蜱虫192 只。

1.2 主要试剂

TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，GeneGreen 核酸染料等，购自天根生化科技（北京）有限公司；Agarose、DL 2 000 DNA Marker 等，购自美国Genview 公司；Premix Taq，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；25X TAE Premixed Powder，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PBS 磷酸盐缓冲液（干粉），购自Biosharp 公司。

1.3 主要仪器

冷冻混合球磨仪（型号：MM400），购自德国Retsch 公司；电泳仪、凝胶成像仪、梯度PCR 仪（型号：PowerPac Basic，Gel Doc XR+，C1000 Thermal Cycler），购自美国Bio-Rad 公司；高速冷冻离心机（型号：FRESCO 21），购自美国赛默飞公司；变焦体视显微镜（型号：SZ-51），购自日本OLYMPUS 公司。

1.4 蜱虫的形态学鉴定

参照《新疆蜱类志》［9］，将蜱置于体视显微镜下观察，主要包括蜱虫的假头基、盾板、气门板、生殖孔、肛侧板等具有形态学鉴定意义的部位，然后将所有的蜱按照雌、雄进行分类编号备用。

1.5 蜱和羊抗凝血样品基因组DNA 提取

用PBS 溶液清洗蜱虫3 遍，逐个放入2 mL 离心管，在离心管内加入合适的钢珠和500 μL PBS溶液，用冷冻混合球磨仪破碎组织后取200 μL 上清液，按照组织DNA 提取试剂盒说明书进行提取；取羊抗凝血样品200 μL，按照DNA 提取试剂盒说明书进行提取。提取好的蜱虫和羊抗凝血基因组DNA 在-20 ℃保存备用。

1.6 PCR 扩增

1.6.1 蜱虫的分子生物学鉴定

参照已报道的蜱虫鉴别引物16S rDNA 和ITS-2［10-11］，采用PCR 法对经过形态学鉴定的蜱虫进行分子生物学鉴定。引物序列信息见表1，委托生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 扩增体系为25 μL：12.5 μL Premix Taq，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O 补至25 μL。16S rDNA 的PCR 反应条件为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃最后延伸5 min。ITS-2 基因的PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃最后延伸5 min。

表1 蜱虫分子生物学鉴定所用引物序列信息 单位：bp

PCR 反应结束前30 min 制备1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR 扩增产物进行电泳，工作电压和时间分别设置为100 V 和50 min，电泳结束后立刻用凝胶成像仪进行拍照，将PCR 阳性产物送至北京新时代众合科技有限公司进行测序，分析测得的基因序列。

1.6.2 蜱和羊抗凝血样品中A.ovis 和A.phagocytophilum 的检测

利用文献［12-14］报道的A.ovis GroEL 基因PCR引物以及A.phagocytophilum 的16S rDNA 巢式PCR 引物，分别对蜱和羊抗凝血样品中的A.ovis和A.phagocytophilum 的携带情况进行检测。引物序列信息见表2，委托生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 扩增体系同“1.6.1 蜱虫的分子生物学鉴定”项下。每次扩增均设置阳性和阴性对照，A.ovis 和A.phagocytophilum 阳性对照为阿克苏市动物疫病控制诊断中心保存的经测序确认的阳 性DNA，DEPC 水 作 为 阴 性 对 照。A.ovis 的GroEL 基因PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃最后延伸5 min。A.phagocytophilum的16S rRNA 巢式PCR 第1 步反应所用引物为16SEE1 引物对，PCR 反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃最后延伸5 min。第2 步反应所用引物为SSAP2 引物对，取第1 步PCR 扩增反应的产物2 μL 作为第2 步PCR 扩增反应的模板，PCR 反应条件同第1 步。上述PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及测序方法同“1.6.1 蜱虫的分子生物学鉴定”项下。

表2 A.ovis 和A.phagocytophilum 检测所用引物序列信息 单位：bp

1.7 数据分析

应用SPSS 22.0 分析软件对不同种类蜱虫和不同区域、不同饲养模式下羊感染无浆体的情况进行统计学分析，采用χ2检验比较检测数据的差异，当P＜0.05 时，表示差异显著，差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蜱虫鉴定结果

经形态学观察，采集的192 只蜱虫包括雄蜱79 只、雌蜱113 只，属于2 属3 种，分别是扇头蜱属的图兰扇头蜱 （Rhipicephalus turanicus，R.turanicus）以及璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticm，H.asiaticm）和 小 亚 璃 眼 蜱（Hyalomma anatolicm，H.anatolicm），所占比例分别为52.60%、45.83%、1.56%（见表3）。不同种属蜱虫的性别分布情况见表3。

表3 蜱虫形态学鉴定结果

使用普通PCR 法扩增蜱虫的线粒体16S rDNA 和ITS-2 基因，分别在460 bp 和821 bp 扩增出目的条带，与预期条带大小相符。对PCR 得到的阳性产物进行测序，获得了3 种基因序列，将测得的基因序列进行同源性分析，确认采集的蜱虫分别为R.turanicus、H.asiaticm、H.anatolicm，与形态学鉴定结果一致。

2.2 蜱虫感染无浆体情况

使用普通PCR 方法扩增蜱样品中A.ovis 的GroEL 基因，使用巢式PCR 方法扩增A.phagocytophilum 的16S rDNA，分别在977 bp 处和641 bp处扩增出阳性条带，片段大小与预期一致 （见图1）。对192 只蜱感染无浆体情况进行统计，结果显示，蜱感染无浆体的总体阳性率为7.29%，其中，A.ovis 阳性率为2.60%，A.phagocytophilum 阳性率为4.69%，二者差异无统计学意义（χ2=1.26，P＞0.05），未检测到A.ovis 和A.phagocytophilum 混合感染（见表4）。

图1 蜱样品中A.ovis 的GroEL 基因和A.phagocytophilum 的16S rDNA PCR 扩增结果

表4 不同种属蜱携带无浆体情况

从不同种属蜱虫感染无浆体情况来看，R.turanicus、H.asiaticm、H.anatolicm 感染无浆体阳性率分别为8.91%、5.68%、0，三者差异有统计学意义（χ2=3.20，P＜0.05）（见表4）。雄蜱整体的阳性率6.33%，雌蜱整体的阳性率为7.96%，二者差异无统计学意义（χ2=0.30，P＞0.05）（见表5）。

表5 不同性别蜱携带无浆体情况

2.3 羊感染无浆体情况

使用普通PCR 方法扩增羊抗凝血样品中A.ovis 的GroEL 基因，使用巢式PCR 方法扩增A.phagocytophilum 的16S rDNA，结果显示，分别在977 bp 和641 bp 处扩增出阳性条带，片段大小与预期一致（见图2）。对477 份羊抗凝血样品进行检测统计，结果显示，在羊的抗凝血样品中检出无浆体的阳性率为51.15%，与蜱样品中无浆体的阳性率差异具有统计学意义（χ2=111.35，P＜0.05）；A.ovis 的阳性率为32.91%，A.phagocytophilum 的阳性率为34.80%，二者差异无统计学意义（χ2=0.38，P＞0.05），A.ovis 与A.phagocytophilum 混合感染率为16.56%。

图2 羊抗凝血样品中A.ovis 的GroEL 基因和A.phagocytophilum 的16S rDNA PCR 扩增结果

2.3.1 不同区域羊感染无浆体情况

对不同县（市）的477 份羊抗凝血样品感染无浆体情况进行统计，结果显示，各县（市）均有无浆体感染，感染率最高的是温宿县，为64.83%，最低的是库车市和沙雅县，均为5.00%，二者差异有统计学意义（χ2=27.72，P＜0.05）（见表6）。

表6 不同县市无浆体感染情况

2.3.2 不同饲养模式羊感染无浆体情况

统计不同饲养模式下477 份羊抗凝血样品感染情况，结果显示，无浆体的阳性率在舍饲和散养模式下分别是28.16%和83.00%，二者差异有统计学意义（χ2=139.81，P＜0.05）（见表7）。

表7 不同饲养模式无浆体感染情况

3 讨论

该研究的蜱虫采集自乌什县边境山区，发现了3 种蜱虫，其中R.turanicus 和H.asiaticm 的数量最多，H.anatolicm 的数量较少，未发现其他种属的蜱虫。

该次采集的蜱虫携带A.ovis 和A.phagocytophilum 的阳性率低于李飞［15］报道的南疆部分地区羊体表蜱虫携带A.ovis 和A.phagocytophilum的阳性率；不同性别蜱虫携带A.ovis 和A.phagocytophilum 的阳性率也有差异，该文中雄蜱携带无浆体的阳性率低于雌蜱携带无浆体阳性率，雄蜱携带A.ovis 和A.phagocytophilum 阳性率均低于雌蜱，王坤轮［16］的调查结果显示：雄蜱和雌蜱携带A.ovis 阳性率高于该文结果，而携带A.phagocytophilum 阳性率低于该文结果。这些差异可能与采样地理环境、动物饲养条件以及蜱虫活跃周期有关。

在该次采集的羊抗凝血样品中检出了阳性，与李佳等［7］在阿克苏市羊抗凝血样品中检出的A.ovis 和A.phagocytophilum 阳性率基本一致。林留霞等［17］调查了阿克苏市绵羊感染A.ovis 的情况，有23.00%的绵羊感染了A.ovis，宁晓冬等［18］在河南部分地区湖羊血液无浆体感染情况调查中发现A.ovis 和A.phagocytophilum 的阳性率分别为24.85%和1.21%。这说明无浆体病在我国各地普遍流行且不同地区存在较大的差异，这可能与当地的优势蜱种、采样环境、地理环境和地域差别以及实验人员的操作差异有关；舍饲模式下无浆体的阳性率为28.16%，要远远低于散养模式下83.00%阳性率，这可能是规模养殖场基础设施比较完善，防疫措施落实相比较散养要好一些，使羊群与蜱虫接触的机会减少；同时，季节性驱虫以及消毒措施相对到位，这也是降低羊群感染无浆体的措施之一。该次调查结果低于金紫薇等［19］在舍饲模式下的调查结果，而在散养模式下高于其调查结果。

阿克苏地区因为有着独特的地理环境和复杂多样的生态环境，是很多蜱传疾病的自然疫源地，因此蜱传疾病是不能忽视的疾病之一。目前防控无浆体病的重点在于控制媒介蜱的活动，从而切断无浆体病的传播途径。由于蜱的种类较多，活动范围较广泛，携带的不同病原感染同一宿主可以引起混合感染，以及羊的饲养方式不同、养殖条件差异等原因，蜱虫的防治效果也不相同［20］。所以，要清楚地了解蜱与无浆体病之间的关系，有针对性地采取措施是十分重要的，该研究为该地区蜱种的鉴定和无浆体病的综合防治提供了一定的参考依据。

4 结论

该次试验总共采集到了R.turanicus、H.asiaticm 和H.anatolicm 3 种蜱虫，在蜱虫和羊抗凝血样品中均检测到A.ovis 和A.phagocytophilum 阳性，说明阿克苏部分地区的蜱和羊普遍感染无浆体，应该加强对无浆体病的防治工作，该试验为该地区做好无浆体病的防控提供一定的依据。